龍膽苦苷鎮(zhèn)痛與抗抑郁的中樞作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　臨床研究強烈提示痛和抑郁具有高度的共患性，患有其中一種疾病后，罹患另外一種疾病的概率就會增加。慢性痛與抑郁的并發(fā)不僅會降低治療效果，增加治療難度，而且嚴重影響患者的生活質量和治療信心。近年來，慢性痛和抑郁錯綜復雜的相互作用備受矚目，被稱為“痛-抑郁綜合征”或者“痛-抑郁二聯征”。目前僅有兩個上市藥物既被批準用于抑郁癥的治療，同時也有外周神經痛、纖維肌痛的適應癥，痛-抑郁綜合征的藥物治療機遇與挑戰(zhàn)并存，是臨床前藥物研

2、究亟需解決的問題。
　　NMDA作為中樞神經系統(tǒng)重要的興奮性受體，在情緒調節(jié)和痛覺的傳遞中發(fā)揮重要的作用。動物實驗和臨床研究表明NMDA受體拮抗劑不但能夠緩解纖維肌痛的疼痛癥狀，而且能夠快速、有效的緩解難治性抑郁患者的癥狀。NMDA受體有望成為痛-抑郁綜合征藥物治療的靶點。然而，現有NMDA受體拮抗劑靜脈注射的給藥途徑以及擬精神病的副作用限制了其臨床應用，因此亟需針對該靶點尋找安全有效的藥物。
　　單胺遞質學說是抑郁癥發(fā)病機

3、理的主流學說，然而基于單胺遞質學說的抗抑郁藥只能緩解50％的抑郁癥狀；即便癥狀被控制，也有60%的患者有復發(fā)傾向。事實上，科學家探索抑郁的發(fā)病機制，尋找新的藥物治療靶點的腳步從未停止。
　　近年來，抑郁的炎癥學說得到了多方面證據的支持。首先，抑郁癥患者血漿和腦脊液中IL-6、TNF-α等炎性因子的水平顯著升高；其次，炎性因子或者炎性因子的誘導劑可以使人或者動物出現抑郁樣癥狀；再次，減弱炎癥反應可以緩解抑郁癥狀。由此可見，炎癥在抑郁

4、的病理過程中發(fā)揮著重要的作用，炎癥通路也可能成為抑郁癥治療的新靶點。
　　炎性因子激活色氨酸降解途徑，導致神經毒性物質及NMDA受體激動劑喹啉酸的蓄積，是炎癥導致抑郁的主要病理學機制。由此可見，抗炎與NMDA受體拮抗雙靶點的藥物有望為抑郁癥的藥物治療提供新的策略。
　　目的與意義：
　　本課題研究了龍膽苦苷（gentiopicroside，Gent）對于利血平誘導的痛-抑郁綜合征、LPS-誘導的抑郁以及LPS誘導的中樞

5、神經系統(tǒng)炎癥的作用及作用機制，評價了Gent的藥代動力學特征和血腦屏障的通透性，首次報道了Gent對抑郁與中樞神經系統(tǒng)炎癥的潛在治療作用，填補了Gent中樞藥理作用研究的空白，為Gent及龍膽屬藥物的開發(fā)提供了依據，也為探索痛-抑郁綜合征和抑郁的藥物治療靶點做了有益的嘗試。
　　研究方法：
　　第一部分Gent對利血平誘導的痛-抑郁綜合征模型小鼠的作用與機制
　　建立利血平誘導的痛-抑郁綜合征小鼠模型，采用熱刺激痛和機

6、械痛評價Gent對痛覺敏感性的影響，采用強迫游泳、懸尾實驗和曠場實驗考察Gent對抑郁樣行為的影響；采用HPLC檢測基底杏仁核腦組織中單胺類神經遞質的變化、試劑盒檢測氧化應激水平的變化，Western blot檢測谷氨酸受體和凋亡相關蛋白的表達，闡明Gent緩解利血平誘導痛-抑郁綜合征的作用機制，并用GluN2B受體阻斷劑進行驗證。
　　第二部分Gent對LPS誘導的抑郁癥模型小鼠的作用與機制
　　建立LPS誘導的小鼠抑郁模

7、型，采用強迫游泳、懸尾實驗和曠場實驗考察Gent對抑郁樣行為的影響；ELISA試劑盒檢測血漿和腦組織中炎性因子的水平；LC-MS/MS檢測腦組織中色氨酸及其代謝產物的變化，用犬尿氨酸/色氨酸表示IDO的酶活性；Western blot檢測相關蛋白的表達，闡明Gent緩解LPS誘導小鼠抑郁樣行為的作用機制。
　　第三部分 Gent對LPS誘導的小鼠中樞神經系統(tǒng)炎癥的作用與機制
　　建立原代培養(yǎng)星形膠質細胞和原代皮層神經元培養(yǎng)體

8、系；采用MTT、ELISA、Western blot以及免疫熒光考察Gent對LPS誘導的星形膠質細胞激活的影響，以及激活星形膠質細胞對神經元損傷的保護作用；采用在體實驗考察Gent對LPS誘導的小鼠中樞神經系統(tǒng)炎癥的作用。
　　第四部分 Gent在小鼠體內的藥動學和血腦屏障的通透性研究
　　建立小鼠血漿、腦組織和腦脊液中Gent含量測定的LC-MS/MS方法并進行方法學驗證；采用DAS2.0軟件對小鼠靜脈注射Gent后的體

9、內過程進行模擬，計算藥代動力學參數；通過比較腦組織和腦脊液中Gent的藥物濃度表征其血腦屏障通透性。
　　研究結果：
　　第一部分
　　1. Gent可以緩解利血平誘導痛-抑郁綜合征模型小鼠對熱刺痛和機械痛的痛敏，改善抑郁樣行為，且具有劑量依賴性；
　　2. Gent可以提高利血平誘導痛-抑郁綜合征模型小鼠BLA中單胺遞質的水平，降低氧化應激，且具有劑量依賴性；
　　3. Gent可以劑量依賴性地下調利血平

10、誘導的BLA腦組織中凋亡相關蛋白和GluN2B的表達，而對GluN2A和GluA1的表達無影響；
　　4. GluN2B受體特異性拮抗劑Ro25-6981也能夠逆轉利血平誘導的氧化應激和BLA腦組織凋亡相關蛋白的表達。
　　第二部分
　　1.小鼠腹腔注射LPS造模24 h后病態(tài)行為消失，出現抑郁樣行為，Gent可以緩解LPS誘導的小鼠抑郁樣行為；
　　2.小鼠腹腔注射LPS造模24 h后，血漿中TNF-α和IL-

11、1β與正常組無顯著差異；但腦組織中仍有差異，Gent可以降低小鼠BLA和PFC腦組織中TNF-α和IL-1β水平；
　　3. Gent可以下調LPS誘導的腦組織中色氨酸代謝途徑的激活；
　　4. Gent可以下調LPS誘導的小鼠PFC腦組織GluN2B的表達。
　　第三部分
　　1. Gent可以抑制LPS誘導的星形膠質細胞的激活，減少炎性因子的釋放，緩解激活星形膠質細胞對神經元的損傷；
　　2. Gent

12、可以通過抑制星形膠質細胞中LPS誘導的MAPK途徑和NF-κB途徑的激活，下調iNOS和COX-2的表達；
　　3. Gent可以下調LPS誘導的小鼠腦組織中iNOS和COX-2的表達，而且其作用與腦區(qū)密切相關。
　　第四部分
　　1.小鼠靜脈注射Gent的體內過程符合一室模型，初始血藥濃度C0為57.4μg/mL；半衰期t1/2為69.3 min；清除率Cl為0.043 L/min/kg；藥-時曲線下面積AUC0-∞

13、為1995.36 mg/L*min；
　　2. Gent可以通過血腦屏障，在腦組織中代謝消除相對較慢，但無蓄積性。
　　研究結論：
　　1. Gent可以緩解利血平誘導的小鼠痛-抑郁綜合征，其作用機制與Gent抗氧化、下調BLA腦組織中GluN2B的表達密切相關；
　　2. Gent可以通過抗炎和下調GluN2B表達的雙重作用緩解炎癥導致的抑郁；
　　3. Gent可以抑制星形膠質細胞中LPS誘導的MAPK