Nrf2對缺氧預處理內皮祖細胞成血管作用的影響及相關機制研究.pdf

1、目的：
　　動脈粥樣硬化所致的缺血性疾病(包括缺血性心臟病、缺血性腦卒中和外周動脈疾病等）嚴重危害中老年人的健康。盡管藥物治療和介入治療取得了巨大進展，但對于急性心肌梗死和冠心病三支血管病變不適合冠脈介入治療患者，促進缺血心肌血管生成，改善心肌供血，對于緩解臨床癥狀、提高心功能和改善預后具有重要意義。內皮祖細胞(EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，具有血管生成的先天優(yōu)勢，因此，通過促進EPCs血管生成和改善組織供血而被廣泛用于細胞

2、移植治療缺血性心臟病和外周動脈粥樣硬化性疾病的研究。然而，由于這些組織多存在嚴重的缺血缺氧的微環(huán)境，不利于細胞生存和發(fā)揮作用，致使大部分移植細胞發(fā)生凋亡或死亡。因此，如何調節(jié)和促進移植的EPCs在缺血組織的生存具有重要研究意義。
　　核因子相關因子-2(Nrf2)是機體抗氧化反應的重要因子，其激活后可以誘導下游多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉錄和表達，從而發(fā)揮抗氧化應激的保護作用?；A研究表明，缺血缺氧組織中存在嚴重的炎癥反應和

3、氧化應激反應，這是促使移植細胞發(fā)生凋亡和壞死的最重要因素。而Nrf2是否涉及移植細胞在缺血缺氧微環(huán)境的生存調節(jié)及其具體機制尚不清楚。缺氧預處理可以增強多種細胞移植治療的療效和功能，Nrf2是否涉及這一過程以及機制如何，亦不清楚。因此，本研究擬應用密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法獲得骨髓源EPCs，運用分子生物學技術使該EPCs過表達Nrf2或降低Nrf2表達，再給予不同缺氧條件下預處理，通過體內外實驗觀察不同缺氧條件下EPCs的生物學特性改變、

4、血管生成能力及其與Nrf2的關系，探討分析Nrf2對缺氧預處理后EPCs的細胞生存、在血管生成中的作用的影響及其機制。
　　方法：
　　1.內皮祖細胞培養(yǎng)及其生物學特性
　　通過密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法從大鼠骨髓獲得骨髓源EPCs，通過培養(yǎng)細胞生長形態(tài)、細胞內吞試驗和流式細胞儀鑒定細胞表面抗原標記三個方法鑒定培養(yǎng)細胞為EPCs。
　　2.Nrf2在缺氧預處理的EPCs中的表達及促血管生成作用與機制研究
　　

5、將EPCs分為四組:1）對照組;2）EPCs-Nrf2-siRNA組;3）EPCs-Con-siRNA組;4) EPCs-Nrf2組。根據實驗目的不同，給予相應缺氧預處理，并進行如下實驗:1)應用熒光探針DCFH-DA試劑盒檢測細胞內ROS水平;2）采用AnnexinⅤ/PI雙染色后行流式細胞儀檢測細胞凋亡水平;3）應用MTT法檢測細胞增殖能力;4）應用細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力;5）應用ELISA法測定細胞培養(yǎng)基中HIF-1α和VE

6、GF水平，評價細胞旁分泌功能;6）應用激光共聚焦檢測缺氧誘導的Nrf2核轉位情況;7）應用熒光實時定量RT-PCR和Western Blot檢測缺氧誘導的信號通路激活情況以及Nrf2與其下游靶基因轉錄和蛋白表達情況。
　　3.Nrf2在EPCs血管生成中的作用及機制
　　體外實驗:應用Tube Formation試驗觀察缺氧誘導的上述四組細胞血管生成能力;體內實驗:建立心肌梗死大鼠模型，并根據移植細胞不同，即EPCs、EPC

7、s-Nrf2-siRNA、EPCs-Con-siRNA和EPCs-Nrf2，相應分為四組:1）對照組;2）EPCs-Nrf2-siRNA組;3) EPCs-Con-siRNA組;4）EPCs-Nrf2組。細胞移植采用心肌梗死交界區(qū)直接注射細胞方法。應用免疫熒光染色觀察不同移植細胞組28d時細胞存活和局部細胞凋亡情況;應用CD31免疫組化染色觀察局部血管生成情況。
　　結果：
　　1)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法可以獲得較大數(shù)量和

8、高純度的EPCs。
　　2)應用細胞內吞試驗和流式細胞儀鑒定細胞表面抗原標記CD34、CD133、KDR和CD31，證明培養(yǎng)細胞為目的細胞EPCs。
　　3)缺氧誘導EPCs產生ROS，并激活Nrf2核內轉位。
　　4)siRNA干擾Nrf2后加重缺氧誘導細胞凋亡，并抑制細胞增殖能力，并降低細胞遷移能力;而高表達Nrf2抑制缺氧誘導的細胞凋亡，增強細胞遷移能力，但對細胞增殖能力無影響，這些結果表明，Nrf2有利于維持缺

9、氧微環(huán)境中的細胞生存。同時，Nrf2正性調節(jié)缺氧誘導的EPCs旁分泌功能。
　　5)缺氧通過激活細胞PI3K/Akt信號途徑而促進Nrf2表達增加，進而誘導細胞中HO-1和NQO1 mRNA轉錄和蛋白表達。
　　6)缺氧誘導EPCs形成膠管樣結構;siRNA干擾Nrf2顯著降低缺氧誘導的EPCs膠管形成能力;在心肌梗死大鼠模型中，siRNA干擾Nrf2顯著減少移植EPCs的生存，伴隨著心肌梗死交界區(qū)毛細血管數(shù)目減少;過表達N

10、rf2則顯著促進移植EPCs的生存，增加心肌梗死交界區(qū)毛細血管毛細血管數(shù)目。
　　結論：
　　1)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法可以獲得較大數(shù)量和高純度的EPCs;細胞內吞試驗和細胞表面抗原標記CD34、CD133、KDR和CD31鑒定證實為EPCs。
　　2) siRNA干擾Nrf2后加重缺氧誘導細胞凋亡，并抑制細胞增殖能力，降低細胞遷移能力;而高表達Nrf2抑制缺氧誘導的細胞凋亡，增強細胞遷移能力，但對細胞增殖能力無影響

11、，這些結果表明，Nrf2有利于維持缺氧微環(huán)境中的細胞生存。同時，Nrf2正性調節(jié)缺氧預處理的EPCs的旁分泌功能。
　　3)膠管形成試驗和動物在體心肌梗死模型實驗顯示，Nrf2參與缺氧誘導的血管生成作用。這個可能是EPCs-Nrf2較EPCs移植治療具有更好改善心功能的原因。
　　4)缺氧誘導EPCs產生ROS，并激活Nrf2核內轉位。
　　5)缺氧通過激活細胞PI3K/Akt信號途徑而誘導Nrf2表達增加，而Nrf2