結直腸側向發(fā)育型腫瘤分子標志物的篩查及其生長機制初探.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分基于iTRAQ定量蛋白組學技術對結直腸側向發(fā)育型腫瘤差異蛋白的鑒定及篩選
　　目的:通過蛋白質組學技術鑒定并分析出結直腸LSTs特異性表達的蛋白質，以期找到導致其側向生長發(fā)育的可能的分子機制;同時探知與其病情進展相關的蛋白質標記物，提高結直腸LSTs的早期診斷率、療效以及改善預后。
　　方法:隨機收取結直腸LSTs、大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉(d＜1cm)

2、、大腸癌及正常對照組大腸組織標本，每組各20例。分別從各組織樣品中提取蛋白，加入胰酶消化，酶解后的多肽用同位素相對與絕對定量(iTRAQ)試劑進行標記，混合標記后的肽段，用強陽離子交換柱(SCX)和反相色譜柱（RPLC）進行二維分離，然后經(jīng)基于QE的液質聯(lián)用進行液相串聯(lián)質譜分析并進行蛋白質定量鑒定，通過Mascot數(shù)據(jù)庫進行檢索得到結直腸LSTs患者的差異蛋白質譜，并對其進行標準生物信息分析。
　　結果:本研究通過同位素相對絕對定

3、量(iTRAQ)技術聯(lián)合多維固/液相色譜與串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)研究策略，共鑒定到4955個蛋白，22587個肽段，其中含21095個Unique肽段。經(jīng)過比對分析，共有2001個蛋白被鑒定為差異表達蛋白，其中上調蛋白數(shù)量分別為:結直腸LSTs組/正常對照組361，結直腸LSTs組/隆起型腺瘤組189，結直腸LSTs組/扁平腺瘤組151，結直腸LSTs組/大腸癌組325;下調蛋白數(shù)量分別為:結直腸LSTs組/正常對照組318，結直

4、腸LSTs組/隆起型腺瘤組201，結直腸LSTs組/扁平腺瘤組153，結直腸LSTs組/大腸癌組303;總差異蛋白數(shù)量分別為:結直腸LSTs組/正常對照組679，結直腸LSTs組/隆起型腺瘤組390，結直腸LSTs組/扁平腺瘤組304，結直腸LSTs組/大腸癌組628。（注:當?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P小于0.05時，視為差異蛋白。）
　　進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，結直腸LSTs存在著特異性表達的蛋白質，即結直腸

5、LSTs與大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉、大腸癌組織及正常大腸粘膜組織相比，均存在著相同的差異性表達的蛋白質共55個:共同上調的差異蛋白質14個，共同下調的差異蛋白質41個。根據(jù)GO功能注釋分析，被鑒定出的結直腸LSTs差異表達的蛋白質中，具有結合功能的差異蛋白所占比例為49.54％，其次是具有酶催化活性作用的蛋白占28.39％，具有酶調節(jié)活性功能的差異蛋白占4.51％，其余差異表達的蛋白質涉及免疫防御反應、血管新生等功能

6、。而被鑒定出的結直腸LSTs55個差異表達的蛋白質中以具有結合功能和運輸代謝功能的蛋白質為主。
　　結論:通過iTRAQ定量蛋白質組學技術，我們成功地鑒定出了結直腸LSTs差異表達的蛋白質譜，并篩選出一批結直腸LSTs特異性表達的蛋白質，其中多種蛋白質具有結合功能、酶調節(jié)活性功能和運輸代謝等功能，提示結直腸LSTs差異表達的蛋白質參與的細胞代謝過程與功能通路在其病程進展過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　第二部分結直腸側向發(fā)育型腫

7、瘤分子標志物的驗證與診斷評價
　　目的:對與結直腸LSTs特異性表達的蛋白質進行鑒定及驗證。
　　方法:隨機收取LSTs及正常對照組血清標本，每組各20例。應用RT-PCR的方法對結直腸LSTs組、隆起型腺瘤組、扁平腺瘤組、大腸癌組及正常對照組大腸組織中差異表達的蛋白質進行mRNA水平的驗證。應用westemblot的方法驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結直腸LSTs、隆起型腺瘤、扁平腺瘤、大腸癌及正常大腸組織中的表達。采用

8、ELISA雙抗夾心法和免疫組織化學驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結直腸LSTs及正常大腸組織中的表達水平。組間比較采用獨立樣本t檢驗（Independent-Samples t Test）或單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法（滿足方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法），Spearman（非雙變量正態(tài)分布資料或者等級資料，相關系數(shù)用rs表示）相關系數(shù)分析LCN2與MM

9、P9蛋白表達以及免疫組化結果與臨床病理特征的相關性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:我們選擇了4個與腫瘤病情進展密切相關但目前在LSTs研究領域報道較少的蛋白即LCN-2、SORD、RAB25、CPA3先進行Real Time PCR實驗。結果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，結直腸LSTs組中LCN-2、SORD、RAB25 mRNA表達顯著升高（P值分別為0.000，0.000，0.043），CPA3 mRNA表達顯著下降(P

10、=0.000)，其中LCN-2 mRNA在5組組織中差異表達的趨勢與蛋白組學結果最為一致。隨后對LCN-2及與其功能密切相關的且在LSTs組織中顯著上調的MMP9蛋白進行Western blot、免疫組化驗證，發(fā)現(xiàn)LCN-2、MMP9在結直腸LSTs組織中的表達較正常組顯著升高（P值分別為0.000，0.000）;且二者在組化中的表達強度相關分析結果表明:MMP-9蛋白表達與LCN-2蛋白表達存在正相關關系(rs=0.631，P=0.0

11、00);且LCN-2、MMP-9蛋白表達均與病理分級存在正相關關系（相關系數(shù)分別為rs=0.943，P=0.000; rs=0.684，P=0.000）。結直腸LSTs患者血清LCN-2、MMP-9蛋白濃度均顯著高于正常對照組(P值分別為0.000，0.000); MMP-9蛋白表達與LCN-2蛋白表達存在正相關關系(rs=0.815，P=0.000);且LCN-2、MMP-9蛋白表達均與病理分級存在正相關關系（相關系數(shù)分別為rs=0.

12、927，P=0.000; rs=0.924，P=0.000）。
　　結論:經(jīng)質譜分析篩選出來的差異蛋白中，LCN-2和MMP-9在結直腸LSTs患者腫瘤組織及血清中的表達水平均顯著增高，且LCN-2在LSTs組織中的表達與其病理分級程度呈正相關，提示LCN-2和MMP-9可能與LSTs病情發(fā)展密切相關，為結直腸LSTs病情進展及分子標志物的研究提供了新的實驗依據(jù)。LCN-2蛋白對于提高結直腸LSTs早期診斷率及改善預后具有較大的臨

13、床應用價值，可能成為預測結直腸LSTs診斷、預后監(jiān)測和防治的重要指標。
　　第三部分結直腸側向發(fā)育型腫瘤生長機制的初步探討
　　目的:利用蛋白組學技術初步探討結直腸側向發(fā)育型腫瘤的側向發(fā)育生長機制。
　　方法:通過透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM)研究結直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織的超微結構，觀察三者細胞間的連接方式，看是否找到與結直腸LSTs側向生

14、長發(fā)育相關的異常結構。應用western blot、免疫組化的方法驗證橋粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP在結直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸組織中的表達。組間比較采用單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法（滿足方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:透射電子顯微鏡(TEM)研究結直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸黏膜

15、組織的超微結構，發(fā)現(xiàn)橋粒數(shù)量及密度在基底層、中間層表達正常，但在上皮側，結直腸LSTs橋粒的數(shù)量及密度較隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織顯著升高（P值分別為0.000，0.000），而且結直腸LSTs上皮側橋粒的數(shù)量及密度最高。用Western blot、免疫組化的實驗方法證實DSG2、 PKP3及JUP的蛋白表達量在結直腸LSTs及隆起型腺瘤中較正常大腸黏膜組織顯著升高(P值分別為0.000，0.000)，且在結直腸LSTs中表達量最高。