重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)轉(zhuǎn)基因兔純合子的篩選及表達特性.pdf

1、血栓性疾病是一類嚴重危害人類健康和生命的疾病，可累及全身各個器官及系統(tǒng)，目前利用溶栓藥物成為治療此類疾病的主要方法。溶栓藥物經(jīng)過不斷研究已發(fā)展到第三代，其中以重組人纖溶酶原激活劑(r-tPA)作為治療人類血栓性疾病的新型藥物。重組人組織纖溶酶原激活劑與天然t-PA具有相似的生物學活性，更具有溶栓能力強、與纖維蛋白親和力高、全身出血副作用小、半衰期長、總使用劑量少等特點。作為第三代溶栓藥物的新型代表，重組人纖溶酶原激活劑越來越受到血栓病患

2、者的青睞，具有廣闊的應用前景。
　　外源基因在轉(zhuǎn)基因純合子動物的整合拷貝數(shù)是轉(zhuǎn)基因半合子動物的兩倍。本研究旨在篩選出轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔，比較外源基因rhPA在轉(zhuǎn)基因純合子兔和轉(zhuǎn)基因半合子兔乳腺中的表達水平，探索在整合位點相同時，rhPA在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中的表達量與其拷貝數(shù)之間的關系。篩選高水平表達的轉(zhuǎn)基因純合子兔，培育用于生物制藥的rhPA的轉(zhuǎn)基因純合子兔品系，為以后大規(guī)模制備溶血栓生物藥品建立基礎，并且用于藥理學和生物學活性分

3、析，有利于后期藥品開發(fā)應用。
　　本研究應用已經(jīng)構(gòu)建的乳腺特異表達載體PCL25/rhPA，通過原核期受精卵顯微注射制備轉(zhuǎn)rhPA基因家兔。經(jīng)過PCR整合檢測和ELISA表達檢測篩選出原代轉(zhuǎn)基因表達兔。F1代轉(zhuǎn)基因表達兔兄妹同胞交配或回交獲得F2代轉(zhuǎn)基因兔，通過對F2代轉(zhuǎn)基因兔測交篩選出其中的轉(zhuǎn)基因純合子兔。ELISA檢測比較轉(zhuǎn)基因純合子兔與半合子兔乳清中rhPA的表達水平。
　　實驗以成年新西蘭母兔為實驗動物，將rhPA基

4、因片段通過顯微注射導入受精卵，移植受體64只，其中46只懷孕，出生仔兔207只，PCR整合陽性兔56只，存活37只。妊娠率為71.9％，陽性整合率為27.1％。
　　ELISA檢測37只轉(zhuǎn)基因兔（或后代）乳汁，其中12只兔乳腺特異性表達rhPA。
　　獲得的rhPA基因表達公兔K29與正常新西蘭母兔交配，共獲得了F1代仔兔25只，經(jīng)PCR檢測篩選出F1代轉(zhuǎn)基因兔16只，其中母兔10只，公兔6只。從F1代轉(zhuǎn)基因兔中挑選公兔和母

5、兔同胞交配，共獲得F2代仔兔10只，經(jīng)PCR檢測篩選出F2代轉(zhuǎn)基因兔5只，其中母兔4只，公兔1只。將F2代轉(zhuǎn)基因兔再與正常兔測交配種，通過對后代的PCR檢測，篩選出F2代中轉(zhuǎn)基因純合子兔。我們從F2代轉(zhuǎn)基因兔中篩選出2只雌性轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔（編號K29 F2-05和K29 F2-09）。通過對K29 F2-09奶樣的ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其乳汁中重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)的表達水平明顯高于半合子轉(zhuǎn)基因兔。
　　本研究獲得

6、了乳腺特異性表達轉(zhuǎn)基因兔，建立了PCL25/rhPA轉(zhuǎn)基因兔基本繁殖群（K29系），并培育篩選出2只轉(zhuǎn)rhPA基因純合子母兔（編號K29 F2-05和K29 F2-09），經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示K29 F2-09母兔奶樣中的rhPA表達量明顯高于轉(zhuǎn)rhPA基因半合子兔。實驗研究結(jié)果證明PCL25/rhPA在轉(zhuǎn)基因純合子兔乳腺中的表達量高于轉(zhuǎn)基因半合子兔的表達量。
　　本研究驗證了以培育轉(zhuǎn)基因純合子動物來提高外源基因表達量的可行性