MicroRNA-34a在非酒精性脂肪性肝病中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　近年來隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD)的患病率逐年增加，成為常見的慢性肝病之一。而NAFLD發(fā)生發(fā)展機制目前尚未完全明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）與肝臟疾病關系密切，我們前期發(fā)現(xiàn)miR-34a在兩種NAFLD模型肝臟中表達均顯著上調，提示miR-34a可能在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用

2、。發(fā)掘并分析miR-34a的作用靶標，對于揭示該miRNA的具體調節(jié)機制有著重要的作用。本研究以定量PCR(qPCR)的方法驗證了miR-34a在NAFLD細胞和小鼠模型中的表達情況，并采用RNA干擾(RNAi)技術研究miR-34a在NAFLD中的生物學功能。同時，對所預測的miR-34a作用靶點PPARα進行驗證。
　　方法:
　　1、采用游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)誘導L02細胞建立NAFLD

3、細胞模型，用高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養(yǎng)C57BL/6小鼠構建NAFLD動物模型，采用qPCR法測定miR-34a在L02細胞及C57BL/6小鼠肝臟中的表達變化;
　　2、通過體外轉染miR-34a inhibitor或小鼠尾靜脈注射miR-34a基因敲減慢病毒載體的方式來進行功能實驗。以油紅O染色、HE染色、生化分析探討miR-34a表達抑制對脂變及炎癥程度的影響;
　　3、結合在線數(shù)據(jù)庫進行miR

4、-34a靶基因的預測，并利用Western blot等進行靶蛋白表達量的驗證，同時利用熒光素酶報告系統(tǒng)對miR-34a的作用靶序列進行鑒定。進一步運用Western blot、qPCR等方法觀察miR-34a表達變化后其靶標基因PPARα下游脂變相關基因的表達變化;
　　4、進一步運用PPARαsiRNA探討PPARα表達抑制對離體肝細胞脂變程度的影響，運用Western blot、 qPCR等方法觀察PPARα表達變化后其下游脂

5、變相關基因的表達變化。
　　結果:
　　1、在NAFLD細胞和小鼠肝組織中miR-34a的表達水平顯著上調;
　　2、通過對L02細胞轉染miR-34a inhibitor或小鼠尾靜脈注射miR-34a基因敲減慢病毒載體抑制miR-34a的表達，L02細胞胞漿及肝臟組織中脂滴沉積的程度得到顯著改善，甘油三酯的含量明顯下降，小鼠肝重/體重比值顯著下降，小鼠血清中AST水平顯著降低;
　　3、采用在線數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)P

6、PARα是miR-34a可能的調控靶基因。我們在L02細胞及C57BL/6小鼠中檢測到PPARα在miR-34a表達抑制后其基因及蛋白水平均有上調。進一步熒光素酶報告系統(tǒng)分析證實PPARα是miR-34a的直接作用靶點，其3'-UTR中存在miR-34a調控的作用序列。PPARα的下游脂變相關基因的表達隨著PPARα的改變而改變。另外，通過抑制miR-34a的表達后，可以激活能量代謝通路上關鍵蛋白AMPK的表達;
　　4、通過對細