CD73-腺苷信號(hào)在MSCs治療EAU中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探索建立小鼠EAU動(dòng)物模型，對(duì)比研究MSCs及阻斷CD73功能的MSCs對(duì)EAU的治療效果，觀察臨床、病理表現(xiàn)及視網(wǎng)膜功能改變，明確CD73在MSCs免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要作用。另外，檢測(cè)小鼠脾臟及頸部引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞增殖能力及分化情況，并分析MSCs對(duì)T淋巴細(xì)胞表面CD73表達(dá)的影響，以闡明MSCs通過(guò)CD73/腺苷信號(hào)對(duì)EAU進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。最終進(jìn)一步完善MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，為臨床應(yīng)用

2、MSCs治療葡萄膜炎等自身免疫性疾病提供新的方法和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.MSCs培養(yǎng)：C57BL/6小鼠脂肪來(lái)源MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定，人脂肪來(lái)源MSCs的分離、培養(yǎng)。
　　2.建立EAU動(dòng)物模型：過(guò)繼轉(zhuǎn)移IRBP1-20抗原特異性T淋巴細(xì)胞至C57BL/6小鼠建立過(guò)繼轉(zhuǎn)移EAU動(dòng)物模型。
　　3.MSCs預(yù)處理：在MSCs體外培養(yǎng)體系中加入CD73競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑APCP，過(guò)夜，待用。
　　4.

3、MSCs治療：過(guò)繼免疫后第10天，PBS對(duì)照組、MSCs治療組及經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs治療組分別行單次尾靜脈注射1ml無(wú)菌PBS、MSCs單細(xì)胞懸液或經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs單細(xì)胞懸液。
　　5.臨床觀察：過(guò)繼免疫后第8天至60天，隔日觀察EAU小鼠眼底發(fā)病情況，并根據(jù)Caspi臨床分級(jí)評(píng)分。
　　6.組織病理學(xué)觀察：過(guò)繼免疫后第60天，處死各組小鼠，制備視網(wǎng)膜組織切片，行組織病理學(xué)觀察，并根據(jù)Caspi病理分級(jí)評(píng)分。

4、
　　7.視網(wǎng)膜功能檢測(cè)：過(guò)繼免疫后第25、35、45、60天分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行ERG檢測(cè)，評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能。
　　8.5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，Brdu）測(cè)定T細(xì)胞增殖：過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第21天，取各組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T細(xì)胞，在0、1、10、30μg/ml IRBP1-20抗原刺激下培養(yǎng)，Brdu法檢測(cè)體內(nèi)T細(xì)胞增殖指數(shù)。另外，取過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第21天模型對(duì)照組EAU小鼠脾臟和引流淋

5、巴結(jié)細(xì)胞，將MSCs或經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs與T淋巴細(xì)胞按1:5、1:10、1:20混合培養(yǎng)，在CD39抑制劑POM-1、CD73抑制劑APCP或A2A腺苷受體拮抗劑SCH58261干預(yù)下，Brdu法檢測(cè)體外T細(xì)胞增殖指數(shù)。
　　9.T細(xì)胞分化檢測(cè)：過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第21天，取模型對(duì)照組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T細(xì)胞，與MSCs或經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs混合培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析CD4+IL-17+細(xì)胞及CD4+Foxp3+細(xì)

6、胞比例。
　　結(jié)論：
　　10.MSCs表面CD73功能檢測(cè)：應(yīng)用孔雀綠比色實(shí)驗(yàn)及高效液相色譜法檢測(cè)CD73的核苷酸外切酶功能及MSCs培養(yǎng)上清中腺苷的生成量。
　　11. T細(xì)胞表面CD73表達(dá)變化檢測(cè)：過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第21天，取模型對(duì)照組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞，與MSCs共培養(yǎng)或在MSCs分泌的各種細(xì)胞因子干預(yù)下混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組活化的CD4+T淋巴細(xì)胞表面CD73的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：

7、
　　1.成功分離培養(yǎng)小鼠脂肪來(lái)源MSCs及人脂肪來(lái)源MSCs，并鑒定。
　　2.成功建立小鼠過(guò)繼免疫EAU模型。
　　3.臨床觀察顯示，MSCs治療組臨床評(píng)分較空白對(duì)照組顯著降低（P<0.05），而經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs治療組臨床評(píng)分顯著高于MSCs治療組（P<0.05）。
　　4.組織病理學(xué)觀察顯示，MSCs療法顯著減輕視網(wǎng)膜組織損傷（P<0.05）。經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs對(duì)于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用大大

8、減弱（P<0.05）。
　　5.視網(wǎng)膜功能檢測(cè)顯示，MSCs療法對(duì)EAU小鼠的視網(wǎng)膜功能具有顯著的保護(hù)作用（P<0.05），而經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs對(duì)視網(wǎng)膜功能的保護(hù)作用大大降低（P<0.05）。
　　6.T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，MSCs可顯著抑制IRBP1-20抗原特異性 T細(xì)胞增殖（P<0.05）。而經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs對(duì)T細(xì)胞的增殖抑制能力大幅減弱（P<0.05）。當(dāng)CD39/CD73/腺苷通路上任何環(huán)節(jié)被阻斷，

9、T細(xì)胞均可呈現(xiàn)顯著增殖。
　　7. T細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)顯示，MSCs共培養(yǎng)可明顯提高CD4+T細(xì)胞中Foxp3+T細(xì)胞相對(duì)于IL-17+T細(xì)胞的比例（P<0.05）。
　　8.孔雀綠比色實(shí)驗(yàn)及高效液相色譜法檢測(cè)顯示，MSCs表面CD73具有核苷酸外切酶的功能，可將AMP降解為腺苷，APCP可顯著抑制其功能（P<0.05）。
　　9. T細(xì)胞表面CD73表達(dá)差異檢測(cè)顯示，MSCs共培養(yǎng)可上調(diào)活化T細(xì)胞表面CD73的表達(dá)水平（