Shox2基因轉染犬骨髓間充質干細胞體外誘導分化培養(yǎng)與功能檢測.pdf

1、背景和目的:
　　病竇綜合征(sick sinus syndrome)是一種常見的嚴重威脅患者生命的緩慢性心律失常，臨床無特效藥物可以根治，主要治療手段是植入人工電子起搏器。雖然電子起搏器的植入能有效改善癥狀、挽救患者生命，但仍存在許多問題:如應激狀態(tài)下缺乏有效的生物反應性、電池使用時間有限、異物植入、外周電磁場干擾等。因此，當前心臟電生理領域研究的一大熱點就是構建一種具有自主搏動能力的“生物心臟起搏器”，以取代電子起搏器。

2、>　　超極化啟動的環(huán)核苷酸門控通道(HCN)的基因亞型HCN4及其介導的起搏離子流(If)是竇房結細胞4期自動去極化形成的關鍵環(huán)節(jié)。既往研究表明，圍繞HCN基因開展的重建生物起搏點的實驗方法，都存在著移植后起搏功能退化或消失的現(xiàn)象。由此可見，僅僅重建If的離子通道無法
　　形成持久有效的生物起搏點。有研究發(fā)現(xiàn)參與胚胎心臟早期發(fā)育的矮小同源盒基因亞型2(Shox2)能夠顯著抑制Nkx2.5并有效上調HCN4的表達，是調控胚胎心臟細胞

3、向竇房結細胞分化的關鍵因素。因此，利用Shox2作為轉錄調控因子誘導多能干細胞向竇房結樣細胞分化，是生物起搏研究的一種理想選擇。本研究在國家自然科學基金(81270246)資助下，將構建好的攜帶mShox2基因的慢病毒載體轉染至骨髓間充質干細胞(MSC)后進行體外誘導分化，運用WB和膜片鉗等實驗方法對Shox2-MSCs進行相關的生理生化檢查，以期探討過表達Shox2基因的cMSCs作為一種生物起搏的“種子細胞”的可行性。
　　研

4、究方法:
　　1.選取健康成年犬一只，麻醉后抽取骨髓，密度梯度離心法結合貼壁法分離培養(yǎng)cMSCs，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特征，流式細胞儀鑒定。
　　2.根據NCBI小鼠Shox2 mRNA序列構建包裝慢病毒載體pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP，載體內攜帶嘌呤霉素抗藥基因用于細胞純化。
　　3.利用構建好的兩種慢病毒載體轉染cMSCs，并進行實驗分組，將轉染后的細胞與心肌細胞(CMs)

5、，再利用嘌呤霉素純化誘導后的cMSCs。
　　4.利用WB、實時定量PCR和免疫熒光技術檢測實驗組細胞Cx43/45、HCN4、Tbx3、Nkx2.5等心肌細胞特異性基因的表達情況。
　　5.全細胞膜片鉗技術檢測誘導分化后Shox2-cMSCs和對照組的離子流通道動力學特征。
　　結果:
　　1.采用密度梯度離心法結合貼壁法分離培養(yǎng)cMSCs，第3代可得到純化的呈典型多邊形或長梭形的細胞，胞體飽滿，折光性好，具有

6、良好的增殖能力和誘導分化潛能。流式細胞儀篩查，CD44和CD29高表達（93.2±3.6％），不表達CD34和CD45，符合MSCs特性。
　　2.在轉染復數(shù)MOI=20的情況下，72 h后熒光顯微鏡下觀察慢病毒對MSCs的轉染效率可以達到（85±4.5）％(n=5）。慢病毒轉染能力好，細胞生長活性未見明顯改變。
　　3.取轉染陽性的cMSCs行體外誘導分化后分為4組:A組(RFP-cMSCs組)、B組(RFP-cMSCs+

7、CMs共培養(yǎng)組)、C組(Shox2-RFP-cMSCs組)、D組(Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組)。
　　4.Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細胞經過共培養(yǎng)誘導分化后心臟傳導系統(tǒng)特異性基因HCN4、Cx45、Tbx3的表達較其他組明顯增加(P＜0.05)，而RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細胞的Nkx2.5及Cx43的表達與其他三組相比明顯增加。
　　5.全細胞膜片鉗結果顯示，Shox2-RF

8、P-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細胞可以記錄到超極化啟動的內向電流，該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性，且對Cs+敏感。根據記錄到的尾電流重建該內向電流啟動曲線和翻轉電位，并進行計算，得到半數(shù)最大激活電壓為-89.4±3.7mV，斜率為-16.3±1.5，翻轉電位是-28.9±6.7mV。而僅轉染RFP的RFP-cMSCs組和RFP-cMSCs+CMs共培養(yǎng)組細胞，未能記錄到超極化啟動的內向電流。
　　結論:
　　1.應用密度

9、梯度離心結合貼壁法分離培養(yǎng)法，早期就可以得到純化的MSCs，具有良好的增殖活性和多向分化潛能。
　　2.構建的慢病毒載體轉染效率高，Shox2-MSCs組細胞穩(wěn)定表達Shox2蛋白，有功能性HCN4通道出現(xiàn)。僅轉染RFP的MSCs未能檢測到HCN4蛋白。
　　3.Shox2-MSCs與CMs共培養(yǎng)誘導分化后，高表達Cx45、Tbx3及HCN4，符合心臟傳導組織的表達特征。對照組細胞高表達Cx43、Nkx2.5，與工作心肌細胞