高糖對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、目的:研究高糖對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)及核因子-κB受體活化因子配體(Receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL)表達(dá)的影響。
　　方法:1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):清潔級(jí)SD大鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組（糖模型組），每組各10只。經(jīng)合理喂養(yǎng)1周。滿(mǎn)足飲食正常、體重(200-250g)及血糖(3-5mmol/l)條件的大鼠用于制造Ⅰ型糖

2、尿病模型。對(duì)照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水(55mg/kg);實(shí)驗(yàn)組經(jīng)腹腔注射鏈尿佐菌素溶液(55mg/kg)。注射藥物1周后大鼠空腹血糖濃度＞16.7mmol/l，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦癥狀者為Ⅰ型糖尿病模型。頸椎脫位法處死大鼠，獲取大鼠胸主動(dòng)脈中膜組織（主要由平滑肌細(xì)胞組成），經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯溶液透明、石蠟滲透包埋制成蠟塊，切片機(jī)切割獲取病理切片，應(yīng)用免疫組化法鑒定對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠主動(dòng)脈中膜組織OPG及RANKL的表達(dá)情況。2

3、、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)滲透壓排除試驗(yàn):分別應(yīng)用低糖（5.5mmol/l）、甘露醇（25mmol/l）、高糖(25mmol/l)三種不同的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(A7R5)，應(yīng)用免疫共沉淀法(Western Blot)檢測(cè)OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)OPG mRNA及RANKL mRNA的表達(dá)。(2)時(shí)間梯度試驗(yàn):固定培養(yǎng)基（糖濃度:25mmol/l）培養(yǎng)A7R5細(xì)胞，分0h、4h

4、、8h、12h、24h、48h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集細(xì)胞并提取蛋白及RNA，應(yīng)用Western Blot及qRT-PCR法分別檢測(cè)OPG、RANKL蛋白及mRNA表達(dá)情況。(3)濃度梯度試驗(yàn):分別應(yīng)用含5.5mmol/l、12.5mmol/l、25mmol/l、50mmol/l四種不同糖濃度的培養(yǎng)基培育A7R5細(xì)胞，培育滿(mǎn)48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取蛋白及RNA，應(yīng)用應(yīng)用Western Blot及qRT-PCR法分別檢測(cè)OPG、RANKL蛋白及mR

5、NA表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):A:動(dòng)物模型結(jié)果:對(duì)照組大鼠體重隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，且未完全出現(xiàn)或不出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，空腹血糖水平＜16.7mmol/l;實(shí)驗(yàn)組大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后體重有增加，但在注射STZ后1周開(kāi)始逐漸出現(xiàn)了兩種變化:a:4只大鼠體重不減輕，但增長(zhǎng)幅度較正常大鼠減弱，未出現(xiàn)明確的多飲、多食及多尿癥狀，空腹血糖水平范圍（5-16.7mmol/l）或(3-5mmol/l)。b:6只大鼠體重在注

6、射STZ后逐漸減輕，且相繼出現(xiàn)多飲、多食及多尿癥狀，空腹血糖＞16.7mmol/l。B:免疫組化結(jié)果:Ⅰ型糖尿病模型大鼠胸主動(dòng)脈中膜組織OPG表達(dá)較正常大鼠增多，病理切片顯示免疫復(fù)合沉淀熒光密度較正常大鼠增強(qiáng)。而RANKL表達(dá)較正常大鼠下降，病理切片顯示免疫復(fù)合沉淀熒光密度較正常大鼠減低。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):A:滲透壓試驗(yàn):高糖組A7R5細(xì)胞OPG蛋白及mRNA的表達(dá)較低糖組升高(P＜0.05)，而RANKL蛋白及mRNA的表達(dá)較低糖組下降

7、(P＜0.05);甘露醇組A7R5細(xì)胞OPG蛋白及mRNA的表達(dá)較低糖組無(wú)明顯改變，對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，RANKL蛋白及mRNA的表達(dá)較低糖組無(wú)明顯改變，統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。B:時(shí)間梯度試驗(yàn):在一定糖濃度（25mmol/l）刺激下，胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞OPG蛋白及mRNA的表達(dá)均隨著培育時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，且各時(shí)間點(diǎn)的蛋白和mRNA表達(dá)水平兩兩對(duì)比統(tǒng)計(jì)皆具有顯著差異(P＜0.05);而RANKL蛋白及mRNA表達(dá)

8、隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，各時(shí)間點(diǎn)蛋白及mRNA表達(dá)水平兩兩對(duì)比統(tǒng)計(jì)皆具有顯著差異(P＜0.05)。C:濃度梯度試驗(yàn):在一定的作用時(shí)間內(nèi)(48h)，隨著培養(yǎng)基含糖濃度的不斷增加，OPG蛋白及mRNA的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且5.5mmol/l、12.5mmol/l及25mmol/l三組兩兩對(duì)比皆存在顯著差異(P＜0.05)，但25mmol/l與50mmol/l組對(duì)比上述蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。RANKL蛋白及mRNA表達(dá)水平隨