MicroRNA-1在食管鱗狀細胞癌中的表達和調(diào)控作用及其潛在診斷價值研究.pdf

1、食管癌是世界上常見的第八大惡性腫瘤，目前中國食管癌發(fā)病率為19.34/10萬，在癌癥新發(fā)病例構(gòu)成中位居第6位，占全部癌癥發(fā)病的7.27％。食管癌死亡率為15.39/10萬，占全部癌癥死亡總數(shù)的8.96%，在癌癥死亡原因中列第4位。根據(jù)食管癌的組織學特點可分為五種類型，其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）所占比例最多，大約占90%，食管腺癌（esophageal adeno

2、carcinoma, EA）次之，占7%左右，其他幾種類型均少見。由于早期癥狀不明顯，缺乏及時發(fā)現(xiàn)和早期診斷的有效方法，臨床上首次確診的食管鱗癌患者80%以上為中、晚期，其5年生存率不及20%，預后極差。因此，對患者進行早診斷、早治療以及尋找診斷食管癌有效的分子生物學標記意義重大。
　　微小RNA（microRNA, miRNA, miR）是一類長度為19-24個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合

3、抑制靶基因 mRNA翻譯或?qū)⑵浣到猓瑥亩谵D(zhuǎn)錄后水平起到基因沉默效應，參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生理功能，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切聯(lián)系。MiR-1由miR-1-133表達簇編碼，其分別位于第18（18q11）和20（20q13）常染色體上，為成熟miR-1和miR-133編碼。miR-1最初作為肌特異性miRNA在心肌和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，參與心肌和骨骼肌的生成。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。研究表明，miR-

4、1在多種腫瘤中異常表達，如在結(jié)腸癌、膀胱癌與腎癌中都表達下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用，但其表達與食管鱗癌臨床病理資料及其可能作用機制的研究少有報道。
　　有多項研究證實，肌動蛋白骨架蛋白1（LIM和SH3蛋白1，LIM and SH3 protein1, LASP1）和肌動蛋白結(jié)合蛋白2（Transgelin-2，曾譯為轉(zhuǎn)膠蛋白）在多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和發(fā)展過程中起非常重要作用，并證明他們是miR-1的靶基因，而此兩種癌基因在食管

5、鱗癌方面的研究少見報道且其與miR-1在食管鱗癌中的關系也未見報道。
　　本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應（ quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測miR-1在食管鱗癌組織和其配對正常組織中的表達，深入分析miR-1的表達水平與食管鱗癌患者臨床病理關系。同時進行miR-1的過表達或沉默，并通過MTT實驗

6、、流式細胞術(shù)檢測凋亡和周期、Transwell實驗，研究其對食管鱗癌細胞株Eca109增殖、凋亡和周期、遷移和侵襲能力的影響，利用雙熒光素酶報告基因分析檢測miR-1對其預測靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用。同時檢測食管鱗癌組織和其配對正常組織中LASP1和TAGLN2的表達情況，分析其與miR-1表達水平的關系。并在最后探討了血漿miR-1作為腫瘤標記物的可能性。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分 miR-1、LAS

7、P1和TAGLN2在食管鱗癌中的表達及其與臨床病理特征關系的研究
　　目的：通過檢測miR-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達，探討其在食管鱗癌中的表達情況及其與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系。
　　方法：采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-1在55例食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達，回顧性分析其表達水平與食管鱗癌患者的臨床病理特征關系。食管鱗癌患者的臨床病理特征包括患者年齡、性別、腫瘤位置、腫

8、瘤TNM分期、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓情況等。選擇與侵襲轉(zhuǎn)移相關的癌基因LASP1和TAGLN2，分別采用qRT-PCR和免疫組織化學法檢測其在食管鱗癌組織和配對正常組織的表達水平，探討其表達水平與食管鱗癌患者的臨床病理特征關系。另外，分析了miR-1與癌基因LASP1和TAGLN2的相關性。
　　結(jié)果：
　　1 miR-1在食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達水平。
　　應用qRT-PCR檢測55例食管鱗癌

9、組織和配對正常組織中miR-1的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中miR-1的表達水平低于相應的癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2 miR-1的表達與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關系。
　　55例食管鱗癌患者中，miR-1的相對表達水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤位置和腫瘤大小無明顯關系（P＞0.05），而與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級和脈管瘤栓等有關（ P=0.002， P=0.000， P

10、=0.022）。
　　3 LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達水平。
　　采用 qRT-PCR和免疫組化法檢測與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關的癌基因LASP1和TAGLN2在55例食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中LASP1和TAGLN2的表達水平顯著高于相應的癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4 LASP1和TAGLN2的表達與食管鱗癌患者臨床病理特征

11、間的關系。
　　55例食管鱗癌患者中，LASP1和TAGLN2的相對表達水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤位置和腫瘤大小無明顯關系（P＞0.05），而與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級和脈管瘤栓等有關（ P=0.000， P=0.000，P=0.008和P=0.000，P=0.001，P=0.008）。
　　5食管鱗癌組織中miR-1與LASP1和TAGLN2的表達呈負相關。
　　經(jīng)Spearman秩相關性檢驗分析發(fā)

12、現(xiàn)，在LASP1低表達的食管鱗癌組織標本（24例）中，miR-1高表達的標本占66.7%（16例/24例）；而LASP1高表達的標本（31例）中，miR-1低表達的標本占87.1%（27例/31例）；miR-1與LASP1蛋白表達水平呈負相關（r＝-0.45，P＜0.05）。在TAGLN2低表達的食管鱗癌組織標本（24例）中，miR-1高表達的標本占50.0%（12例/24例）；而TAGLN2高表達的標本（31例）中，miR-1低表達的

13、標本占74.2%（23例/31例）；miR-1與TAGLN2蛋白表達水平呈負相關（r＝-0.382，P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 miR-1在食管鱗癌組織中表達顯著低于配對正常組織，而 LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織中表達顯著高于配對正常組織。
　　2 miR-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織中的表達與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級和脈管瘤栓等有關。
　　3 miR-1與癌基因

14、LASP1和 TAGLN2存在顯著負相關關系，提示miR-1可能在食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。
　　第二部分 miR-1對食管鱗癌細胞生物學行為影響的體外實驗研究
　　目的：研究miR-1對于食管鱗癌細胞生物學行為包括細胞增殖、細胞凋亡和周期、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法：體外轉(zhuǎn)染miR-1模擬物或是抑制物或其陰性對照，通過MTT、流式細胞術(shù)、細胞遷移和侵襲實驗在體外觀察 miR-1在食管鱗癌細胞Eca109增

15、殖、凋亡和周期、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果：
　　1 miR-1對食管鱗癌細胞株Eca109細胞增殖能力的影響。
　　MTT細胞增殖實驗檢測結(jié)果顯示，食管鱗癌細胞在24 h、48 h、72 h細胞增殖率 mimics-miR-1組與 mimics-miR-1 control組比較降低，而inhibitor-miR-1組與inhibitor-miR-1 control組比較增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

16、，表明miR-1對食管鱗癌細胞增殖具有抑制作用。
　　2 miR-1對人食管鱗癌細胞株Eca109細胞凋亡與周期的影響。
　　流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48h后， mimics-miR-1組與mimics-miR-1 control組比較和inhibitor-miR-1組與inhibitor-miR-1 control組比較，Eca109細胞在凋亡率和細胞周期方面未發(fā)生明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

17、>　　3 miR-1對人食管鱗癌細胞株Eca109細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　Transwell分析結(jié)果顯示，mimics-miR-1組與mimics-miR-1 control組相比，mimics-miR-1組Eca109細胞遷移和侵襲到下室的細胞數(shù)明顯少于mimics-miR-1 control組（P＜0.05），說明其遷移和侵襲能力明顯減弱；inhibitor-miR-1組與 inhibitor-miR-1 control組比

18、較，inhibitor-miR-1組Eca109細胞下室的細胞數(shù)明顯增多，說明其遷移和侵襲能力明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組實驗結(jié)果一致，說明miR-1基因能夠影響Eca109細胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)論：miR-1可抑制食管鱗癌細胞Eca109的增殖、遷移和侵襲能力，而對細胞凋亡和周期無影響。
　　第三部分 miR-1調(diào)控LASP1和TAGLN2表達的實驗研究
　　目的：探討食管鱗癌中miR-

19、1對于LASP1和TAGLN2表達的相關調(diào)控關系。
　　方法：運用 MicroRNA生物信息學網(wǎng)站和軟件，對其可能的作用靶序列進行預測分析，結(jié)合miR-1在食管鱗癌細胞中發(fā)揮的生物學功能，進行進一步篩選。通過雙熒光素酶報告基因分析的方法檢測miR-1對其預測靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用，采用Western-blot驗證食管鱗癌細胞株Eca109中miR-1對其預測靶基因表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1生物信

20、息學軟件預測靶基因，并雙熒光素酶驗證 miR-1對LASP1和TAGLN2的靶向作用。
　　生物信息學軟件 TargetScan預測結(jié)果提示，miR-1序列可以分別與LASP1和TAGLN2 mRNA的3’-UTR區(qū)相結(jié)合，其兩者可能為miR-1的靶基因。
　　我們進一步通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測了miR-1與LASP1和TAGLN2基因 mRNA3’-UTR區(qū)結(jié)合位點的活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimics-miR-1后能夠

21、顯著降低食管鱗癌細胞Eca109中LASP1和TAGLN2的相對熒光強度，分別是對照組轉(zhuǎn)染了 mimics-miR-1 control的42%和31%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示LASP1和TAGLN2是miR-1的下游調(diào)控靶分子，miR-1與LASP1和TAGLN2的3’-UTR結(jié)合后對它們進行負性調(diào)控。
　　2在食管鱗癌細胞株Eca109中過表達miR-1對LASP1和TAGLN2蛋白表達的影響
　　Wes

22、tern blot檢測miR-1轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組及對照組靶基因LASP1和 TAGLN2蛋白表達變化。結(jié)果顯示， mimics-miR-1組的 LASP1和TAGLN2蛋白表達水平低于其對應 mimics-miR-1 control組，而inhibitor-miR-1組的 LASP1和 TAGLN2蛋白表達水平高于其對應inhibitor-miR-1 control組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　

23、1 miR-1可以通過與LASP1和TAGLN2的mRNA3’-UTR區(qū)結(jié)合抑制其表達，證明LASP1和TAGLN2是miR-1的靶基因。
　　2在食管鱗癌患者中miR-1可能是通過LASP1和TAGLN2途徑調(diào)控食管鱗癌的發(fā)展。
　　第四部分血漿miR-1作為食管鱗癌腫瘤標志物的潛在診斷價值的研究
　　目的：研究食管鱗癌患者外周血中 miR-1的表達情況，探討其在食管鱗癌診斷中的應用。
　　方法：采集23例初治

24、食管鱗癌患者及11例體檢健康人的血漿標本，提取 RNA后采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應（ quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測血漿miR-1表達水平，分析其與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關系；同時比較其中10對術(shù)前和術(shù)后7~10 d食管鱗癌患者手術(shù)前后miR-1表達水平的變化；繪制受試者工作特征曲線并分析其診斷食管鱗

25、癌的價值。
　　結(jié)果：
　　1食管鱗癌患者和健康對照組血漿中miR-1的表達水平。
　　應用實時熒光定量 PCR檢測食管鱗癌組與健康對照組血漿中 miR-1的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者比對照組健康人血漿中miR-1的表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2血漿miR-1在食管鱗癌患者手術(shù)前后表達變化。
　　食管鱗癌患者術(shù)后7-10 d外周血中miR-1的表達水平較術(shù)前顯著升高，差異具

26、有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　3血漿miR-1表達與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關系。
　　血漿miR-1的相對表達水平與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小均無明顯相關性（ P＞0.05）；但與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關（P=0.005）；與組織學分級呈負相關，但統(tǒng)計學無差異（P=0.083）。
　　4血漿miR-1在食管鱗癌診斷中的價值。
　　以23例食管鱗癌患者及11例健康對照者血漿miR-1的相對

27、表達量繪制ROC曲線，分析顯示，通過檢測血漿miR-1水平來區(qū)分健康人和食管鱗癌患者的曲線下面積是0.881[95%的置信區(qū)間（ confidence interval,95%CI）：0.743-1］，臨界值取0.688時，其特異度87%，靈敏度81.8%（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1血漿 miR-1在食管鱗癌患者中的表達明顯下調(diào)，且食管鱗癌術(shù)后miR-1表達上調(diào)。
　　2血漿miR-1有望成為用于食管鱗癌篩查