Toll樣受體4表達調控在促紅細胞生成素抗炎與抑制大鼠心肌纖維化中的作用與機制研究.pdf

1、目的:心血管疾病是全球范圍內人類的第一死因。而心肌纖維化是多種心血管疾?。ㄈ缧募」Ｋ?、高血壓等）的病理基礎，它是心肌重構的關鍵病理特征和重要形成原因。已有研究證實促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)能夠通過抑制心肌纖維化而起到保護心肌的作用，但是其具體作用機制尚不清楚。本研究欲探討EPO拮抗心肌纖維化的具體機制，為心肌重構和心肌纖維化的臨床防治提供新思路、新靶點和新方向，為EPO在心血管疾病中的應用提供更多的理論依據(jù)。

2、
　　方法:250-300g健康成年SD雄性大鼠30只，隨機分成五組:對照組(Control)、腹主動脈縮窄動物模型組(AAC)、EPO過表達組(AAC+EPO)EPO和TLR4共過表達組(AAC+EPO+TLR4)和PI3K抑制劑組(AAC+EPO+LY294002)。AAC組大鼠行腹主動脈縮窄手術;AAC+EPO組大鼠行腹主動脈縮窄手術后通過心肌內注射感染EPO慢病毒;AAC+EPO+TLR4組大鼠行腹主動脈縮窄手術后通過心肌

3、內注射同時感染EPO和TLR4慢病毒;AAC+EPO+LY294002組行腹主動脈縮窄手術后通過心肌內注射感染EPO慢病毒，并連續(xù)腹腔注射LY294002一個月;Control組不行腹主動脈縮窄但行同樣切口并縫合，心肌內注射等量生理鹽水;各組大鼠均在8周后處死取材。蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色觀察大鼠心肌組織病理變化;qPCR用于檢測大鼠心肌組織中PI3K、Akt1和TLR4的mRNA水平;Western blotting用于

4、檢測大鼠心肌組織中PI3K、p-Akt、TLR4、TGF-β1、MMP-2和MMP-9等蛋白表達水平;免疫熒光用于觀察大鼠心肌組織中TLR4、TGF-β1、TNF-α、MMP-2和MMP-9的表達水平;酶聯(lián)免疫檢測法檢測大鼠血清中TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A等各項生化指標變化。
　　結果:1、HE染色結果顯示，與Control組相比，AAC組心肌細胞直徑增大，心肌纖維束較寬大，肌纖維間疏松水腫，間隙

5、增寬，AAC+EPO組與AAC組相比心肌損傷較輕，AAC+EPO+TLR4組與AAC+EPO+LY294002組和AAC+EPO組相比，心肌損傷明顯加重。Masson染色結果顯示，與Control組相比，AAC組心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂，膠原沉積嚴重，而AAC+EPO組心肌細胞相對于AAC組，心肌纖維排列較整齊，膠原沉積較輕;AAC+EPO+TLR4組和AAC+EPO+LY294002組與AAC+EPO組相比，心肌纖維排列明顯紊亂

6、，膠原沉積明顯加重。2、qPCR結果顯示，與Control組相比，AAC組TLR4 mRNA水平顯著上調，PI3K、Akt1的mRNA水平則顯著下降(P＜0.05);AAC+EPO組較AAC組TLR4的mRNA表達水平顯著下調，PI3K、Akt1表達水平顯著上調(P＜0.05);AAC+EPO+TLR4組較AAC+EPO組TLR4的mRNA表達量上調(P＜0.05)，AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組TLR4 mRNA

7、表達量上調，PI3K、Akt1 mRNA水平則顯著下降(P＜0.05)。3、Western blotting結果顯示，與Control組相比，AAC組TLR4、TGF-β1、MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著上調，PI3K、p-Akt表達水平則顯著下降(P＜0.05);AAC+EPO組較AAC組TLR4、TGF-β1、MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著下調，PI3K、p-Akt表達水平顯著上調(P＜0.05);AAC+EPO+TLR

8、4組較AAC+EPO組TLR4、TGF-β1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量上調(P＜0.05)，AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組TLR4、TGF-β1、MMP-2、MMP-9蛋白表達量上調，PI3K、p-Akt表達水平則顯著下降(P＜0.05)。4、免疫熒光染色結果顯示，與Control組相比，AAC組TLR4、TGF-β1、TNF-α、MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著上調(P＜0.05);AAC+EPO組較

9、AAC組TLR4、TGF-β1、TNF-α、 MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著下調(P＜0.05)，AAC+EPO+TLR4組和AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組TLR4、TGF-β1、TNF-α、MMP-2、MMP-9蛋白表達量顯著上調(P＜0.05)。5、ELISA檢測結果顯示，與Control組相比，AAC組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A等濃度顯著增加(P＜0.05)，

10、AAC+EPO組較AAC組顯著降低(P＜0.05)，而AAC+EPO+TLR4組和AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組顯著增加(P＜0.05)。
　　結論:1、EPO能夠顯著抑制心肌纖維化，改善心肌重構，與其能夠抑制炎癥因子的表達關系密切;2、EPO發(fā)揮抗心肌纖維化的作用可能是由TLR4介導參與的;3、EPO可能是通過PI3K/Akt信號通路，下調TLR4的表達，進而減少TGF-β1、IL-1β、IL-6、IL-1