沉默Beclin1基因對雨蛙素誘導急性胰腺炎細胞模型的炎癥反應及自噬的影響.pdf

1、目的:
　　自噬是生物體進化過程中存在的高度保守的細胞內物質降解過程，細胞通過形成雙層膜結構的自噬體吞噬胞內物質后轉運至溶酶體中進行降解再利用。自噬在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究是當前急性胰腺炎基礎研究領域的主要熱點之一。自噬相關基因Beclin1是自噬起始階段的重要調控分子，本研究首先采用RNA干擾技術沉默大鼠胰腺腺泡細胞AR42J的Beclin1基因表達，構建穩(wěn)定的Beclin1基因沉默的AR42J細胞系。通過原始細胞系與轉

2、染后細胞株的對比，我們了解Beclin1基因在AR42J細胞的增殖、凋亡、自噬及糜蛋白酶表達中的作用，并進一步探討B(tài)eclin1基因對雨蛙素誘導的的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平、凋亡、自噬及超微結構的影響。
　　方法:
　　1.設計并合成3種靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及陰性對照shRNA，分別插入質粒GV112，重組質粒分別命名為p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Be

3、clin1-3及p-shRNA-NC。應用lipo3000將重組質粒瞬轉入AR42J細胞，應用RT-PCR檢測細胞Beclin1 mRNA表達，篩選出沉默效率最高的質粒，在293T細胞內包裝成慢病毒(LV-shBeclin1)，感染AR42J細胞，應用嘌呤霉素篩選，采用RT-PCR及蛋白質印跡法分別檢測病毒感染細胞Beclin1 mRNA和蛋白表達。
　　2.采用CCK8試劑盒測定原始細胞系與轉染后細胞株的生長曲線，了解Becli

4、n1基因對AR42J細胞增殖的作用。采用流式細胞技術檢測原始細胞系與轉染后細胞株的凋亡情況，了解Beclin1基因對AR42J細胞凋亡的影響。采用透射電鏡觀察兩組細胞的超微結構，了解Beclin1基因對AR42J細胞中自噬影響。采用免疫熒光技術觀察兩組細胞糜蛋白酶的表達情況，了解Beclin1基因對AR42J細胞中糜蛋白酶表達的影響。
　　3.采用酶聯免疫吸附實驗檢測雨蛙素誘導的的急性胰腺炎細胞模型不同時間點(0h、1h、4h、6

5、h、8h、12h、24h、36h及48h)上清液中的炎性因子水平，及沉默Beclin1基因后炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的改變，從而探討沉默Beclin1基因對雨蛙素誘導的的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平的影響。采用蛋白質印跡法檢測雨蛙素誘導的急性胰腺炎細胞模型中不同時間點(0h、1h、4h、6h、8h、12h、24h及36h)的凋亡相關蛋白BCL2及自噬相關蛋白LC3表達水平，及沉默Beclin1基因后BCL2及

6、LC3蛋白水平的改變，從而探討沉默Beclin1基因對雨蛙素誘導的的急性胰腺炎細胞模型中凋亡及自噬的影響。采用透射電鏡技術觀察以1×10-8mol/L濃度的雨蛙素作用4h后的兩組細胞中自噬水平及炎癥程度，從而探討沉默Beclin1基因對雨蛙素誘導的的急性胰腺炎細胞模型超微結構的影響。
　　結果:
　　1.重組質粒經瓊脂糖凝膠電泳分離及測序證實shRNA序列符合預期。p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、

7、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC轉染后AR42J細胞Beclin1 mRNA表達抑制率分別為（17.8±4.0）％、（30.6±2.8）％、（45.8±7.7）％、（7.0±11.8）％。3個p-sh-Beclin1轉染細胞的表達抑制率均較未轉染細胞的差異有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），而轉染p-shRNA-NC細胞的表達抑制率與未轉染細胞的差異無統(tǒng)計學意義。抑制率最高的p-sh-Beclin1-3經慢病毒包裝，感染

8、AR42J細胞，應用嘌呤霉素篩選，LV-shBeclin1感染細胞的Beclin1 mRNA表達抑制率為（86.1±1.2）％，蛋白表達抑制率為（87.9±2.8）％，均與未感染細胞無表達抑制的差異有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）。
　　2.沉默Beclin1基因對AR42J細胞增殖的影響并無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但可以促進細胞的凋亡。沉默Beclin1基因使得AR42J細胞中自噬泡數目減少，但并不影響細胞糜蛋白酶的表達。<

9、br>　　3.酶聯免疫吸附實驗提示急性胰腺炎初期炎性因子水平逐步上升，6～8h時達最高峰后炎性因子水平逐漸下降后再次升高，36～48h時達到第二次高峰。沉默Beclin1基因后，相應時間點的IL-1β水平下降、IL-6水平多數無明顯改變、TNF-α水平多數呈上升趨勢。蛋白質印跡法提示沉默Beclin1基因使得雨蛙素誘導的急性胰腺炎中不同時間點的BCL2多數下降，而LC3蛋白多數升高。以1×10-8mol/L濃度的雨蛙素作用4h后，AR4

10、2J細胞中出現急性胰腺炎現象，而轉染后細胞株中自噬泡明顯減少，且并未觀察到炎癥改變。
　　結論:
　　成功建立Beclin1基因沉默的AR42J細胞株。Beclin1基因參與自噬體的形成，且可以抑制AR42J細胞的凋亡，它對細胞增殖和糜蛋白酶表達并無明顯影響。雨蛙素誘導的急性胰腺炎細胞模型中炎性因子水平隨時間變化，呈先升后降再升的模式改變。沉默Beclin1基因影響急性胰腺炎中炎性因子水平，及凋亡自噬的程度，且它對雨蛙素誘導