青島文昌魚彈性蛋白酶基因的鑒定、表達(dá)分析和功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、彈性蛋白酶(Elastase,Elas)是絲氨酸蛋白酶家族的一員,以水解不溶性彈性硬蛋白(Elastin)為特征,具有廣泛的水解蛋白活性。已在包括無脊椎動物和脊椎動物的很多物種中被鑒定,但是在文昌魚中對于此類蛋白功能卻了解甚少。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物,一直被認(rèn)為是研究脊椎動物起源和進(jìn)化的模式動物。本文從青島文昌魚(Branchiostomabelcheri)cDNA文庫中,分離出具有完整編碼框的Elas基因(B

2、bElas),并對其結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。 首先,從文昌魚cDNA文庫中克隆到全長為987 bp的BbElas cDNA,其最大開放閱讀框編碼277個氨基酸的蛋白質(zhì),理論分子量為29 kDa,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)有一長為16個氨基酸的信號肽。該cDNA編碼的蛋白(BbElas)同脊椎動物的ELAS一樣,在氨基酸序列的31-267位具有一個完整的Tryp SPc結(jié)構(gòu)域,具有高度保守的GDSGGPL序列和催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)位點(diǎn)

3、His74-Asp127-Ser222,并且在氨基酸序列的59位、75位、161位、191位、207位、218位、228位和248位具有8個相當(dāng)保守的半胱氨酸。將BbElas同其他物種ELAS蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),BbElas與無脊椎動物的ELAS聚為一支,且位于脊椎動物ELAS的根部,進(jìn)一步表明了文昌魚在進(jìn)化上的地位。 其次,我們還研究了ELAS基因在文昌魚中的表達(dá)情況。Northern Blotting和切片原

4、位雜交表明,BbElas在成體組織中腸中的表達(dá)量較高,具有組織特異性。 為了研究BbElas的功能,我們構(gòu)建原核表達(dá)載體,導(dǎo)入E.Coli誘導(dǎo)表達(dá)。BbElas在包涵體中大量表達(dá);經(jīng)透析復(fù)性后,純化出重組蛋白BbElas。用重組蛋白作用于彈性蛋白酶特異性底物N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide,發(fā)現(xiàn)它能夠降解該底物,用該底物對酶活進(jìn)行了測定,得到復(fù)性后的重組蛋白活性為0.22±0.02 U/

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