表皮生長因子對脊髓損傷后血脊髓屏障的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)性損傷，通常會引起機體的永久性癱瘓，同時直接導致脊髓微血管損傷和血脊髓屏障(Bloodspinal cord barrier，BSCB)通透性的破壞。BSCB主要由無窗孔的內(nèi)皮細胞、基底膜、周皮細胞和星形膠質(zhì)細胞終足組成，它能夠為脊髓中的細胞成分提供特殊的微環(huán)境，從而對脊髓起到保護和調(diào)節(jié)作用;目前很多實驗研究顯示BSCB通透性的改變參與了

2、SCI的病理發(fā)生發(fā)展過程，神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎癥細胞通過BSCB從而引起膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞的“程序性死亡”，進而導致永久性神經(jīng)缺陷。表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)由53個氨基酸組成的6 kD多肽，其受體廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，具有廣泛的生物學效應，包括促細胞增殖、遷移、分化等。同時作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它具有促進神經(jīng)元生長及保護神經(jīng)元的作用。研究發(fā)現(xiàn)，EGF可促進血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞的增

3、殖分化，刺激膠原酶和血纖溶酶激活物的釋放，促進上皮細胞的遷移并促進其分裂增生、毛細血管的形成，從而為組織修復提供豐富的血液營養(yǎng)。我們研究結采發(fā)現(xiàn)EGF可以促進大鼠SCI后BSCB的修復，進一步研究EGF的作用機制發(fā)現(xiàn):EGF促進大鼠SCI后BSCB的修復是通過激活PI3K/Akt/Rac1信號通路介導的。
　　方法及結果:
　　(1)采用打擊型方法來制作SD大鼠急性脊髓損傷動物模型，即用脊髓打擊器(150 kdyn)打擊脊髓

4、T8～10段造成中度脊髓損傷模型。將雌性SD大鼠隨機分為假手術組、SCI組、SCI+EGF組，根據(jù)不同時間點又分為1d，3d，7d，14d四組，采用BBB行為學評分對其后肢運動功能進行評價。發(fā)現(xiàn)給予SCI+EGF組3d，7d，14d的BBB評分優(yōu)于SCI組，說明EGF能促進大鼠脊髓損傷后運動功能的部分恢復。隨后于1d，7d兩個時間點處死大鼠，收集約1cm脊髓損傷節(jié)段作為組織標本分別用于冰凍切片觀察伊文思藍(Evans Blue，EB)熒

5、光、石蠟包埋切片HE染色、免疫熒光、Western blot以及其他指標的檢測。從HE染色切片上觀察脊髓損傷后細胞形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)SCI+EGF組的損傷脊髓組織出血、核固縮等損傷比SCI組明顯減輕。根據(jù)EB染色發(fā)現(xiàn)，SCI破壞了大鼠的BSCB，導致脊髓損傷周圍的EB滲透量明顯增加，檢測其熒光強度也顯著增大。而SCI+EGF組發(fā)現(xiàn)EB滲透量和熒光強度明顯降低，Western blot檢測BSCB相關蛋白的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)SCI+EGF組的

6、緊密連接蛋白（Claudin-5、Occludin）和粘附蛋白（p120-Catenin、β-Catenin）的表達明顯升高相對于SCI組，表明EGF對大鼠血腦屏障具有保護作用。在體外實驗中，我們用糖氧剝奪模型(Oxygen GlucoseDeprivation，OGD)作用人腦微血管內(nèi)皮細胞(Human brain microveselendothelia cells，HBMECs)模擬體內(nèi)BSCB模型，用FITC-dextran檢測

7、通透性，用免疫熒光法以及Western blot法檢測細胞蛋白的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)HBMECs在OGD作用之后FITC-dextran滲透量增加，緊密連接蛋白和粘附蛋白下調(diào)，而給予EGF組可以減少FITC-dextran滲透量和促進細胞緊密連接蛋白、粘附蛋白的上調(diào)。
　　(2)在發(fā)現(xiàn)EGF對SCI后BSCB具有修復作用，為了進一步探索EGF是通過何種機制來對BSCB起到保護作用的。結合相關文獻報道，發(fā)現(xiàn)EGF可以激活PI3K/Ak

8、t信號通路，同時Rac1能夠參與對緊密連接蛋白和粘附蛋白的調(diào)節(jié)，結合本課題實驗，我們發(fā)現(xiàn)SCI后p-Akt/Akt和Rac1這兩個蛋白表達下調(diào)，這一結果在體外BSCB模型得到了驗證。因此，我們引入了PI3K/Akt抑制劑(LY294002)和Rac1 siRNA來進一步證實EGF對PI3K/Akt和Rac1的調(diào)控作用。結果顯示當分別阻斷這兩個通路時，EGF對BSCB的通透性和相關蛋白的保護作用都被部分抑制。這一結果在體外BSCB模型得到