番茄紅素保護線粒體DNA減輕心肌缺血-再灌注損傷的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　心血管疾病是人類健康的第一殺手，隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展和人口老齡化，我國心血管疾病的患病率持續(xù)增加，心肌梗死的發(fā)生率也日益升高。心肌梗死常常危及生命，盡早有效地恢復缺血心肌血液供應，是阻止缺血性心肌損傷的發(fā)展、減小梗死面積進而改善臨床預后的根本措施。然而，缺血心肌恢復血液灌注后產(chǎn)生的再灌注損傷往往難以避免。除此之外，再灌注損傷也常常存在于器官移植、體外循環(huán)、休克復蘇等情況中。
　　近年來，盡管在缺血/再灌注損傷的防治

2、和機制研究中已經(jīng)取得了很大的進展，但如何有效的預防和減輕缺血/再灌注損傷仍然是臨床工作者們面臨的重要難題。有研究表明氧化應激和線粒體功能障礙在缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。線粒體DNA易受到氧化應激損傷。但缺血/再灌注損傷與線粒體DNA之間的關系尚不明確。
　　番茄紅素是一種脂溶性的抗氧化劑，屬于類胡蘿卜素中的一種，富含于番茄及其它各種紅色蔬菜和水果之中，常溫下呈紅褐色長針狀晶體。最近有研究表明番茄紅素可以保護線粒體DNA使其

3、免于氧化損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠減輕缺氧/復氧引起的心肌細胞凋亡。
　　目的：本研究旨在探討線粒體DNA損傷在心肌缺血/再灌注損傷中的作用及其可能的機制，以及番茄紅素能否通過保護線粒體DNA減輕心肌缺血/再灌注損傷，同時我們對番茄紅素保護線粒體DNA的機制也進行了探討。
　　方法:
　　1.大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型:結扎心臟冠狀動脈左前降支，30 min后打開結扎部位讓心肌重新獲得血液灌注并持續(xù)24 h。H9

4、c2細胞缺血/再灌注損傷的體外模型:將H9c2細胞缺氧6h，復氧12h。為了驗證缺血/再灌注能夠引起線粒體DNA的損傷，通過免疫熒光的方法來檢測心肌組織及H9c2細胞中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，并通過COXⅣ抗體來識別心肌組織中的線粒體，通過線粒體的紅色熒光探針Mitotracker Red來標定H9c2細胞中的線粒體，觀察8-OHdG是否與線粒體重合。同時，通過實時熒光定量PCR來檢測心肌組織及H9c2細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)

5、及線粒體DNA基因轉錄水平的變化。
　　2.為了明確在上述缺血/再灌注動物模型和細胞模型中是否存在線粒體功能障礙，通過試劑盒對心肌組織及H9c2細胞中的ATP進行檢測。同時，還通過熒光探針JC-1對H9c2細胞線粒體膜電位進行檢測。
　　3.為了明確線粒體DNA損傷本身是否能夠導致線粒體功能障礙，用低濃度的溴化乙錠處理H9c2細胞來耗竭細胞中的線粒體DNA，然后對H9c2細胞的線粒體膜電位，細胞中的ATP水平以及細胞存活率進

6、行檢測。同時，對H9c2細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體DNA基因轉錄水平也進行了檢測。
　　4.為了明確番茄紅素是否能夠通過保護線粒體DNA來減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷。通過2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色的方法來測定大鼠心肌缺血/再灌注后心臟的梗死面積。收集大鼠血漿，檢測肌鈣蛋白、乳酸脫氫酶以及肌酸激酶等心肌損傷生物標記物。通過Tunel染色檢測心肌組織及H9c2細胞中凋亡細胞的比率。通過免疫印跡法檢測水解的ca

7、spase-3蛋白的表達量。對H9c2細胞進行AnnexinⅤ及PI共染色，然后經(jīng)流式細胞儀分析其中凋亡細胞的比率。同時，為了明確番茄紅素對線粒體DNA以及線粒體功能的保護作用，也檢測了心肌組織及H9c2細胞中8-OHdG的含量，線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA基因轉錄水平，線粒體膜電位以及細胞中ATP水平。
　　5.為了探討番茄紅素減輕線粒體DNA損傷的機制，對心肌組織及H9c2細胞中的MDA，ROS以及線粒體內(nèi)超氧化物含量進行

8、了檢測。同時，為了進一步明確番茄紅素保護線粒體DNA的作用是否與減輕氧化應激有關，在細胞實驗中通過H2O2處理H9c2細胞，造成線粒體DNA的氧化損傷，觀察番茄紅素對H2O2引起的線粒體DNA損傷及線粒體功能障礙是否具有保護作用。
　　6.為了進一步探討番茄紅素減輕線粒體DNA損傷的機制，我們還通過免疫印跡和免疫熒光染色的方法對線粒體轉錄因子（調(diào)節(jié)線粒體DNA拷貝、轉錄以及維持核樣結構的關鍵蛋白因子）進行了檢測。
　　結果:

9、
　　1.在缺血/再灌注的動物實驗和細胞實驗中都發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注導致了8-OHdG的大量生成，且大部分與線粒體重合。PCR的結果提示線粒體DNA拷貝數(shù)和基因轉錄水平均明顯降低。這些結果表明心肌的缺血/再灌注損傷與線粒體DNA損傷有關。
　　2.動物實驗和細胞實驗都證實，缺血/再灌注導致細胞內(nèi)ATP水平明顯降低。細胞實驗證明，缺血/再灌注后H9c2細胞線粒體膜電位明顯降低。這些結果表明缺血/再灌注引起了細胞線粒體功能障礙。<

10、br>　　3.為了明確線粒體DNA損傷與線粒體功能障礙的關系，在細胞實驗中通過向H9c2細胞加入低濃度的溴化乙錠的方法耗竭線粒體中的DNA，觀察其對線粒體功能及細胞存活的影響。結果發(fā)現(xiàn)，加入溴化乙錠后細胞中線粒體DNA的拷貝數(shù)和基因轉錄水平隨著時間的推移逐漸降低，同時也觀察到細胞中ATP的水平及線粒體膜電位也逐漸降低，而線粒體中超氧物陰離子的濃度卻逐漸增加，細胞活力逐漸下降。這些結果表明線粒體DNA損傷可以導致線粒體功能障礙，細胞死亡。

11、
　　4.番茄紅素預處理能使大鼠心肌缺血/再灌注后的心臟梗死面積明顯減少，使血漿中的心肌損傷標記物水平降低。在細胞實驗中番茄紅素能明顯抑制缺氧/復氧導致的細胞死亡。在動物實驗和細胞實驗中都證明，番茄紅素能使Tunel陽性的細胞數(shù)減少，使激活的caspase-3蛋白的表達量降低，使AnnexinⅤ染色陽性的細胞比率降低，表明番茄紅素能夠抑制缺血/再灌注引起的細胞凋亡。同時，在動物實驗和細胞實驗中都發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠有效的防止缺血/再灌

12、注引起的8-OHdG的生成以及線粒體DNA拷貝數(shù)與線粒體DNA基因轉錄水平的下降。番茄紅素還防止了缺血/再灌注引起的ATP水平的降低和線粒體膜電位的下降。這些結果表明番茄紅素可以通過保護線粒體DNA，減輕線粒體功能障礙，抑制細胞凋亡，來減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷。
　　5.線粒體DNA特別容易受到氧化應激損傷。番茄紅素能夠明顯抑制缺血/再灌注引起的MDA以及活性氧的生成。番茄紅素也能夠抑制H2O2引起的線粒體DNA損傷及線粒體

13、功能障礙。
　　6.通過對與線粒體DNA的拷貝、轉錄以及維持核樣結構密切相關的關鍵蛋白因子Tfam的檢測，發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注以后線粒體中Tfam的表達量明顯降低，而番茄紅素能有效的抑制線粒體中Tfam的下降。
　　結論:
　　本實驗研究結果表明:線粒體DNA損傷在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用;番茄紅素可通過保護線粒體DNA減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷，其保護線粒體DNA的作用可能與其減輕線粒體氧化應激以及