單核細胞增生李斯特菌：無菌斑馬魚感染模型及Mmp-9在抗細菌感染中的作用機制.pdf

1、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌）作為四大食源性病原菌之一，在環(huán)境中廣泛存在，且對不良環(huán)境的耐受能力較強。人和動物食用了單增李斯特菌污染的食物后，細菌進入消化道并跨越宿主腸道屏障，隨血液循環(huán)分布至全身臟器中，或穿過血腦屏障和胎盤屏障造成腦炎和流產等。單增李斯特菌擁有一套十分強大的毒力因子系統(tǒng)，感染過程中對宿主細胞的黏附和侵襲、細胞內增殖和細胞間擴散的每一步都由特定的毒力因子介導。內化素

2、A(InlA)是該菌介導細菌黏附細胞的分子之一，能夠與宿主細胞表面的E-鈣黏蛋白共價結合，不同種宿主的E-鈣黏蛋白識別位點不同，因此InlA的識別具有宿主特異性。經(jīng)口感染單增李斯特菌在人源細胞上的黏附效率比在小鼠細胞上更高，是由于小鼠腸上皮細胞的E-鈣黏蛋白與人的在第16位氨基酸上有差異，不能與InlA有效結合。而斑馬魚的E-鈣黏蛋白在此位點上與人相同。
　　斑馬魚作為重要的模式脊椎動物之一，具有繁殖能力強、體外受精和發(fā)育、性成熟

3、周期短，胚胎透明、易于遺傳操作等諸多優(yōu)點。斑馬魚具有與哺乳動物相似類型的免疫細胞，且先天免疫系統(tǒng)在胚胎時期獨立于后天免疫而存在。以斑馬魚為模式動物建立病原微生物感染模型，對于病原的致病機制、宿主的先天免疫功能和病原與宿主之間互作關系的研究具有重要意義。然而普通斑馬魚飼養(yǎng)環(huán)境及其腸道內的微生物可能會影響特定病原感染的研究，因此以斑馬魚為模型進行感染與免疫研究需采用無菌斑馬魚。
　　本研究旨在:(1)建立無菌斑馬魚胚胎培養(yǎng)體系;(2)

4、建立單增李斯特菌多種途徑感染無菌斑馬魚胚胎的方法;(3)探明李斯特菌感染無菌斑馬魚胚胎轉錄組學特征;(4)探明基質金屬蛋白酶9(Mmp-9)在介導巨噬細胞遷移和抗感染中的作用機制。
　　1.斑馬魚胚胎的無菌培養(yǎng)及評價
　　斑馬魚胚胎時期，后天免疫尚未發(fā)育（受精后4-6周），該時期是研究先天免疫功能的最佳時期。由于斑馬魚生活環(huán)境中微生物易大量繁殖，斑馬魚腸道中也有共生的微生物菌群，會激活斑馬魚先天免疫系統(tǒng)，從而影響試驗結果。本

5、研究成功建立了斑馬魚胚胎培育的無菌操作系統(tǒng)，無菌檢驗顯示其生活環(huán)境及體內未檢測到能形成菌落的病原微生物，先天免疫分子Toll樣受體分子(Toll-likereceptors，TLRs)表達量較低或不表達，而常規(guī)培養(yǎng)斑馬魚以及浸泡感染單增李斯特菌的無菌斑馬魚中這些基因轉錄水平較高。我們認為該無菌系統(tǒng)培育的斑馬魚胚胎能夠達到“相對無菌”，其先天免疫尚未激活，可應用于免疫系統(tǒng)功能、腸道固有菌群功能和特定病原感染機制等研究中。
　　2.單

6、增李斯特菌不同感染途徑對斑馬魚致病性的影響
　　卵黃注射單增李斯特菌強毒株EGDe能夠引起斑馬魚迅速死亡，注射EGDe的斑馬魚卵孵化率為18％，相比弱毒株M7組80％、無害李斯特菌組88％和對照組90％的孵化率有顯著下降。腦室注射單增李斯特菌能夠引起斑馬魚胚胎逐漸死亡，并且能夠觀察到巨噬細胞遷移至腦內吞噬細菌，細菌能夠在巨噬細胞中增殖。靜脈注射100 CFU強毒株EGDe后就能導致魚在一周內全部死亡，細菌能夠在全身軀干血管、主靜脈

7、及眼周血管中分布并大量增殖，引起嚴重的感染。而弱毒株及無害李斯特菌則在感染后一定時間內被魚體清除。以上三種注射感染途徑中，李斯特菌屬不同菌株的毒力與在小鼠模型中毒力相似:EGDe＞ M7＞無害李斯特菡。用高達1010 CFU/mL的EGDe浸泡感染斑馬魚雖不能引起死亡，但冰凍切片顯示48 hpi(hours post infection)時細菌大量存在于魚腸腔中未能突破腸道屏障，且在72 hpi被全部清除。強毒株感染組先天免疫基因cyp

8、1a、irgll、il1b和mmp9的轉錄水平顯著高于弱毒株感染組、無害李斯特菌感染組和未感染組。這些基因表達在48 hpi達到頂峰，在72 hpi回落至正常水平，提示可能是這些基因參與了細菌清除。
　　3.致病性與非致病性李斯特菌浸泡感染斑馬魚幼魚的比較轉錄組學
　　應用Affymetrix基因芯片對斑馬魚14900個基因轉錄本進行雜交檢測，發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌感染的斑馬魚相對于空白對照組有239個基因表達上調(fold≥2.

9、0)，56個基因表達下調(fold≤0.5)。無害李斯特菌感染的斑馬魚相對于空白對照組僅有25個基因上調，4個下調。而單增李斯特菌感染的斑馬魚相對于無害李斯特菌感染的魚有102個基因上調。其中Mmp-9上調倍數(shù)最多，達20倍以上。熒光定量檢測大部分基因表達趨勢與基因芯片結果一致。對單增李斯特菌感染組相對空白對照組上調的239個基因和相對于無害李斯特菌感染組上調的102個基因分別進行Gene Ontology(GO)分析，發(fā)現(xiàn)這些上調的基

10、因大多富集于GO:0005576和GO:0050896，分別與細胞外基質穩(wěn)態(tài)平衡和抵御應激相關。將這些基因進行Gene Cluster分析，發(fā)現(xiàn)在緊密連接、信號轉導、干擾素、熱休克蛋白、纖連蛋白、補體和肌動蛋白等分類下的基因均有不同程度的上調。這些結果提示斑馬魚可能通過改變細胞外基質的穩(wěn)態(tài)來抵御單增李斯特菌感染，這一過程中Mmp-9可能發(fā)揮了重要作用。
　　4.Mmp-9在斑馬魚抗感染過程中的作用機制
　　Mmp-9屬于基質

11、金屬蛋白酶家族，是一種鋅離子依賴的膠原蛋白酶，作用底物廣泛，能在各種細胞中表達并參與組織修復、細胞運動、炎癥發(fā)生等多項生理及病理過程，近來也有報道Mmp-9在抗感染過程中也發(fā)揮一定作用。早期的研究均認為Mmp-9水解細胞外基質，有助于巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞在細胞外基質中遷移。最近有研究發(fā)現(xiàn)，Mmp-9可能參與細胞內信號轉導，激活細胞運動相關的通路，從而引起細胞遷移運動。我們利用特異Morpholino注射單細胞階段的魚卵，抑制M

12、mp-9表達，并對Mmp-9抑制后的魚進行腦室注射、靜脈注射及浸泡感染。結果顯示，靜脈注射感染Mmp-9抑制的魚在24 hpi細菌載量顯著高于正常魚，在感染后2-3天內全部死亡，比正常魚感染后死亡快。腦室注射感染后，Mmp-9抑制的魚中遷移至腦內的巨噬細胞數(shù)顯著低于正常魚。浸泡感染雖仍不引起斑馬魚死亡，但Mmp-9抑制的魚出現(xiàn)消化道出血現(xiàn)象。
　　本研究還利用RNA干擾技術，結合小分子化學藥物作用，在小鼠巨噬細胞RAW264.7細

13、胞模型上，對Mmp-9可能誘導的通路分子進行了探索。細菌感染及LPS刺激能夠引起Mmp-9表達提高，同時也導致RAW264.7在Transwell上的遷移能力增強。沉默Mmp-9或Mmp-9在細胞內可能的受體分子CD44均能導致細胞體外遷移能力減弱，但Mmp-9的沉默不影響細胞吞噬細菌的能力和形成偽足的能力，也不影響細菌ActA作用引起的actin tail形成。抑制細胞RhoA通路上游分子FAK，中游分子ROCK均能在一定程度上減少由

14、Mmp-9上調引起的細胞遷移，用細胞松弛素抑制肌動蛋白聚集后，由Mmp-9上調增多的細胞遷移活動完全被抑制。以上結果提示Mmp-9在抗感染過程中能夠介導巨噬細胞遷移至感染部位，從而達到清除細菌的作用。Mmp-9通過非水解酶作用，與CD44或其他細胞表面受體結合，誘導細胞運動相關RhoA通路，從而引發(fā)細胞遷移運動。
　　綜上所述，本研究建立了簡易的無菌斑馬魚胚胎培養(yǎng)體系，用此無菌系統(tǒng)培育的斑馬魚胚胎先天免疫尚未激活，可用于其先天免疫