lncRNA AK095203在胃癌進(jìn)展中的機(jī)制研究及氧化鈰納米顆粒治療胃癌的研究.pdf

1、腫瘤的化療耐藥是導(dǎo)致腫瘤患者治療過程中死亡的主要原因，但腫瘤化療耐藥具體的分子機(jī)制并不清楚。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA。目前越來越多的研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，發(fā)揮著重要的作用。lncRNA發(fā)揮作用的機(jī)制較為復(fù)雜，近年來文獻(xiàn)指出，lncRNA可以通過吸附microRNA間接調(diào)控基因的表達(dá)，參與腫瘤進(jìn)程;可以通過吸附蛋白，對蛋白進(jìn)行修飾

2、，從而通過調(diào)控蛋白水平發(fā)揮作用;也可以在細(xì)胞核中富集，通過招募或者阻礙某些核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在基因的表達(dá)層面發(fā)揮調(diào)控作用;還可以實現(xiàn)對核小體空間的重新構(gòu)向，繼而改變基因的表達(dá)。lncRNA豐富的調(diào)控機(jī)制，使得lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮多種不同的功能。目前已有文獻(xiàn)報道，某些lncRNA參與了腫瘤的化療耐藥過程，可能是導(dǎo)致腫瘤化療耐藥的關(guān)鍵因素。因此，研究lncRNA在腫瘤化療耐藥中的關(guān)鍵作用，將可以闡明腫瘤發(fā)生化療耐藥的新機(jī)制，補(bǔ)

3、充腫瘤進(jìn)展的理論依據(jù)，為臨床治療提供新的策略和藥物作用靶點。
　　目的:本研究通過篩選在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNA，并分析其在胃癌化療耐藥中的作用。
　　方法:
　　(1)通過lncRNA芯片篩選出在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNA;
　　(2)通過qRT-PCR技術(shù)，在60例胃癌患者中檢測該lncRNA的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理資料，分析該lncRNA的臨床相關(guān)性;
　　(3)檢測該lncRNA在不同胃

4、癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并通過干擾慢病毒在高表達(dá)該lncRNA的胃癌細(xì)胞中降低其表達(dá)，形成穩(wěn)定低表達(dá)的胃癌細(xì)胞系作為模型;
　　(4)采用CCK8實驗、Transwell實驗、劃痕實驗、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、裸鼠皮下成瘤實驗、裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移實驗、裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗，對該lncRNA的功能進(jìn)行檢測;
　　(5)通過原位雜交技術(shù)，檢測lncRNA在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中的定位情況;
　　(6)通過表達(dá)譜芯片分析該lncRNA參與

5、細(xì)胞的具體功能;
　　(7)通過RNA pull-down技術(shù)檢測該lncRNA可能結(jié)合的蛋白，并分析其余l(xiāng)ncRNA功能之間的關(guān)系;
　　(8)檢測lncRNA的表達(dá)對于胃癌細(xì)胞奧沙利鉑敏感性的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)篩選在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNA:我們通過lncRNA芯片篩選出在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNAs，并通過表達(dá)倍數(shù)、表達(dá)特異性篩選出15條在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNA。同時在10例胃

6、癌患者癌組織和癌旁組織中進(jìn)行驗證，最終確定表達(dá)差異最明顯且最有統(tǒng)計學(xué)意義的lncRNA為lncRNA AK095203。
　　(2)lncRNA AK095203在胃癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義:我們通過qRT-PCR實驗，在60例胃癌組織和癌旁組織中檢測lncRNA AK095203的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)lncRNAAK095203在胃癌組織中高表達(dá)(P=0.00662)，且lncRNA的表達(dá)與胃癌大小呈正相關(guān)，與胃癌分化程度呈反相

7、關(guān)。
　　(3)lncRNA AK095203的表達(dá)對胃癌細(xì)胞行為學(xué)的影響:我們通過構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC7901和BGC823，CCK8實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA AK095203的低表達(dá)，胃癌細(xì)胞的增殖能力受到了明顯抑制;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNAAK095203的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞難以進(jìn)入G2期;Transwell實驗和劃痕實驗表明，干擾lncRNA AK095203可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力;

8、裸鼠皮下成瘤實驗、裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移實驗、裸鼠強(qiáng)制肺轉(zhuǎn)移實驗則從體內(nèi)實驗角度證明了干擾lncRNAAK095203的表達(dá)，胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到了明顯抑制。
　　(4)lncRNA AK095203在胃癌細(xì)胞和組織中的定位:我們通過原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，lncRNAAK095203主要在細(xì)胞核中富集。
　　(5)表達(dá)譜芯片分析lncRNA AK095203的具體功能:我們通過表達(dá)譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA AK0952

9、03的表達(dá)后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂相關(guān)基因、DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)受到了明顯抑制，提示lncRNA AK095203與細(xì)胞分裂、DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)。
　　(6)我們通過RNA pull-down實驗發(fā)現(xiàn)，lncRNAAK095203可以與SSRP1和H2A/H2B結(jié)合，而SSRP1與胃癌奧沙利鉑導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)，lncRNAAK095203可能是通過與SSRP1結(jié)合，從而導(dǎo)致胃癌奧沙利鉑耐藥的。
　　(7)

10、我們發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA AK095203的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC7901和BGC823對奧沙利鉑敏感性明顯增加。
　　結(jié)論:
　　(1)我們通過lncRNA芯片和qRT-PCR實驗，篩選出一條在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNA，即lncRNA AK095203，并通過臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，該lncRNA的表達(dá)與胃癌大小、分化程度密切相關(guān)。
　　(2)轉(zhuǎn)染干擾慢病毒，形成穩(wěn)定抑制lncRNA AK095203表達(dá)的細(xì)胞系

11、，并通過體內(nèi)體外實驗發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA AK095203的表達(dá)，胃癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力受到了明顯抑制。
　　(3)表達(dá)譜芯片顯示，lncRNA AK095203的表達(dá)，與細(xì)胞分裂功能、DNA損傷修復(fù)關(guān)系密切。
　　(4)通過RNA pull-down實驗和原位雜交聯(lián)合免疫熒光實驗，我們初步證明lncRNAAK095203可以與SSRP1和H2A/H2B結(jié)合。干擾lncRNA AK095203的表達(dá)，胃癌細(xì)胞對奧沙利