蘆丁抑制H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　白內(nèi)障是老齡化人口中引起視力下降和致盲的首要原因，已經(jīng)成為一個不容忽視的全球性的公共健康問題之一。晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是人類和動物非先天性白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的共同的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。氧自由基又是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的主要原因。因此，抑制晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷和凋亡對預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。研究表明蘆丁具有顯著的清除各種自由基的特性?；谝陨嫌^點(diǎn)，在本研究中我們將建立人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷模型，通過檢測不同的氧化損

2、傷、凋亡等指標(biāo)系統(tǒng)地觀察天然抗氧化劑蘆丁對H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷和凋亡的影響，并且進(jìn)一步探討其中可能的機(jī)制。為臨床上藥物治療早期白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展提供新的研究方向。
　　方法：
　　1．取對數(shù)生長周期的 SRA01/04人晶狀體上皮細(xì)胞，分別加入0,50,100,200,400,800μM H2O2及0,25,50,100,200,400μM蘆丁，處理24h后采用MTT法分別測量每組的細(xì)胞生存率，據(jù)此設(shè)計實(shí)驗

3、所需的蘆丁和H2O2濃度。
　　2．將細(xì)胞分為5組，對照組，H2O2組，25μM蘆丁組，50μM蘆丁組，100μM蘆丁組。MMT法檢測各組細(xì)胞的生存率，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞劃痕法檢測各組細(xì)胞的遷移率。評價不同濃度蘆丁對細(xì)胞形態(tài)以及對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3．使用DCFH-DA法測量上述各組細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量；使用黃嘌呤氧化法檢測各組細(xì)胞的超氧化物歧化酶（SOD）活性；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗（ELIS

4、A）法檢測各組細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）水平。觀察蘆丁對細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。
　　4．采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測上述各組細(xì)胞的凋亡率，階梯 DNA電泳法檢測各組細(xì)胞DNA梯度的形成；DAPI核染色法觀察各組細(xì)胞的核的形態(tài)變化。分別從形態(tài)學(xué)水平、分子水平對蘆丁抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行評估。
　　5．運(yùn)用 JC-1染色對各組細(xì)胞線粒體膜電位（ΔΨm）的變化進(jìn)行檢測，運(yùn)用western-blot方法對各組

5、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2, Bax以及caspase-3的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。以明確蘆丁是否通過調(diào)控線粒體依賴的Bcl-2/Bax家族而發(fā)揮作用
　　6．將細(xì)胞分為4組，對照組，H2O2組，100μM蘆丁組， PDTC(NFκB的抑制劑)組，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測NFκB蛋白的激活和由胞漿向胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，使用western-blot方法對各組中細(xì)胞核NFκB蛋白以及胞漿IκB蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。以明確NFκB信號通道是否參與了

6、蘆丁對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用
　　7．將細(xì)胞分為4組，對照組、H2O2組、100μM蘆丁組、20μMPD98059組(ERK1/2的抑制劑)/10μMSB203580組(p38的抑制劑)/10μMSP600125組(JNK的抑制劑)，應(yīng)用Western-blot方法檢測MAPK信號通路中pERK、pp38、pJNK蛋白表達(dá)量的變化。以明確 MAPK信號通道是否參與了蘆丁對 H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用。
　　結(jié)

7、果：
　　1.與對照組相比，H2O2組細(xì)胞生存率、遷移率明顯下降（P<0.05），與 H2O2組相比，不同濃度的蘆丁組細(xì)胞生存率、遷移率明顯提高（P<0.05）；與對照組相比，H2O2組形態(tài)異常的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，不同濃度的蘆丁組中形態(tài)異常的細(xì)胞數(shù)目較 H2O2組明顯減少；提示蘆丁抑制 H2O2對細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞生存率，維持細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定。
　　2.與H2O2組相比，蘆丁組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平明顯下降（P<0.05）

8、，SOD、GSH水平明顯增加（P<0.05）。.蘆丁抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)。
　　3.流式細(xì)胞學(xué)的檢查提示不同濃度的蘆丁組細(xì)胞凋亡率較 H2O2組明顯下降（P<0.01）。階梯DNA電泳實(shí)驗結(jié)果顯示H2O2組中出現(xiàn)了典型的DNA階梯，而在25μmol/L蘆丁組僅有少量條帶出現(xiàn)，50、100μmol/L蘆丁組與對照組均無明顯條帶出現(xiàn)。DAPI核染色結(jié)果顯示在 H2O2組中出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、核

9、崩解為脆片、輪廓不規(guī)則及偏位等形態(tài)學(xué)上的改變。在蘆丁組中，細(xì)胞核形態(tài)上的改變明顯較H2O2組減少。提示蘆丁在形態(tài)學(xué)水平和分子水平都可以抑制 H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且呈一定的劑量效應(yīng)趨勢。
　　4.不同濃度的蘆丁組細(xì)胞ΔΨm較H2O2組明顯上升（P<0.05），并且呈一定的劑量效應(yīng)趨勢。不同濃度的蘆丁組在蛋白水平能夠有效地抑制 H2O2誘導(dǎo)的 Bax, caspases-3的表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)減少（P<0.01）。提示蘆丁

10、可以保護(hù)ΔΨm的穩(wěn)定，可能通過調(diào)控線粒體依賴的Bcl-2/Bax家族抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡
　　5、免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果顯示在受到H2O2刺激后NF-кB蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，蘆丁/PDTC可以明顯抑制NF-кB的核轉(zhuǎn)移。western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，H2O2組細(xì)胞核內(nèi)NF-кB蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞內(nèi)總IкB蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），而蘆丁或PDTC組可以抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)NF-кB的蛋白

11、表達(dá)的增加以及細(xì)胞總IкB的表達(dá)下降（P<0.01）。表明NF-кB信通道參與了蘆丁抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　6.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)：H2O2組中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白的表達(dá)量明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而在蘆丁組和各條通道的抑制劑組中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白的表達(dá)低于H2O2組（P<0.01）。提示MAPK信號通道參與了蘆丁對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的