pH依賴性抗人FcRn單鏈抗體的開發(fā)及其對大分子藥物半衰期延長功能的應(yīng)用研究.pdf

1、迄今為止，已有200多種蛋白藥物被批準(zhǔn)用于臨床治療，但大多數(shù)蛋白和多肽藥物在體內(nèi)的半衰期僅有數(shù)分鐘至數(shù)小時，其在體內(nèi)的快速降解給蛋白藥物的臨床應(yīng)用帶來了極大的不便，尋找延長蛋白藥物半衰期的方法是很多藥物研發(fā)科學(xué)家的重要研究方向。目前，延長蛋白藥物半衰期的策略主要有增加分子大小和利用FcRn的循環(huán)機制等，而應(yīng)用FcRn對 IgG和 SA的循環(huán)機制延長目的分子在體內(nèi)的半衰期是目前應(yīng)用最廣泛、最成功的方法之一。FcRn通過與IgG和SA的pH

2、依賴性結(jié)合，即在酸性pH條件下結(jié)合，在中性pH條件下解離來保護IgG和SA免遭快速降解，應(yīng)用這一原理開發(fā)的長效蛋白藥物如Fc融合蛋白、SA融合蛋白等已被廣泛應(yīng)用于臨床，但它們的半衰期雖然有所延長，但與天然的IgG和SA相比仍然太短，因此，開發(fā)高親和力、有pH依賴性的FcRn結(jié)合配體，一直是長效藥物研發(fā)的重要課題之一。
　　本研究分別應(yīng)用單鏈抗體噬菌體文庫技術(shù)進行了抗 FcRn抗體的開發(fā)，通過優(yōu)化篩選方案，我們篩選到十幾個不同的抗體

3、基因序列，將這些抗體基因重組表達后，通過hFcRn蛋白ELISA和表達hFcRn細胞的流式細胞技術(shù)鑒定，我們從中鑒定出兩株特異性識別 hFcRn的單鏈抗體，我們分別命名為FnAb-8和FnAb-12。它們對hFcRn的高度pH依賴性在蛋白水平和細胞水平的測試中得到了驗證。應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)（SPR），我們對兩株抗體的親和力進行了測定，兩者的親和力分別為5.62±1.69nM(n=3)和31.6±21.6nM(n=3)，比hIgG和S

4、A與FcRn的親和力高出數(shù)十倍到數(shù)百倍。對兩株抗體的種屬交叉實驗結(jié)果表明，F(xiàn)nAb-8與猴FcRn的結(jié)合與人FcRn基本相同，但它與小鼠FcRn的結(jié)合比較弱，而FnAb-12與猴FcRn的結(jié)合比人FcRn稍弱，而與小鼠FcRn基本不結(jié)合。體內(nèi)藥代動力學(xué)研究結(jié)果證實FnAb-8與FcRn的高親和力在體內(nèi)確實可以轉(zhuǎn)化成半衰期的延長，其在食蟹猴體內(nèi)的平均滯留時間長達約240小時。
　　應(yīng)用該單鏈抗體與 GLP-1表達融合蛋白，結(jié)果表明，