絲素-膠原蛋白支架聯(lián)合雪旺細胞及脂肪干細胞共培養(yǎng)修復大鼠坐骨神經缺損的研究.pdf

1、目的：
　　組織工程化神經作為自體神經移植的有效替代物，被廣泛用于橋接神經缺損及引導神經生長的研究。組織工程化神經和自體神經移植的最大區(qū)別在于它們所處的再生微環(huán)境不同。如果提供一個理想的再生微環(huán)境，組織工程化神經對周圍神經的缺損修復還很切實可行的。本研究為了最大程度上地模擬機體再生微環(huán)境，我們選擇共培養(yǎng)雪旺細胞和脂肪干細胞作為種子細胞，并進一步地將它們引入絲素/膠原蛋白神經支架中，以此來構建組織工程化神經。然后用于修復大鼠坐骨神經

2、10mm缺損，術后12周行電生理學及形態(tài)分析學等一系列檢查評估神經再生情況。
　　方法：
　　1.分離培養(yǎng)大鼠雪旺細胞（SCs），并行光鏡下形態(tài)觀察及雪旺細胞標記物S-100免疫熒光染色鑒定；分離培養(yǎng)大鼠脂肪干細胞（ADSCs），并取其第3代行流式細胞儀分析，觀察其表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105表達情況；取第3代雪旺細胞與脂肪干細胞按2∶1比例進行共培養(yǎng)，每天倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化

3、。培養(yǎng)14天后，采用免疫熒光染色檢測MAP2、 NeuN和GFAP神經特異標志物表達情況。
　　2.絲素/膠原蛋白神經支架的制備：以桑蠶絲和牛腱為原料制備絲素蛋白和膠原蛋白，將二者按質量比為2∶1比例進行共混，冷凍，真空干燥，制備絲素/膠原蛋白神經復合支架。
　　3.組織工程化神經的構建及性能檢測：將共培養(yǎng)的雪旺細胞-脂肪干細胞引入絲素/膠原蛋白神經支架構建組織工程化神經，掃描電鏡（SEM）觀察支架內部結構及細胞在內部的生長

4、增殖情況；采用 Instron5865力學試驗機測其力學性能。
　　4.大鼠坐骨神經缺損模型的建立及不同神經移植物修復神經缺損：單純絲素/膠原支架移植組(Scaffold組)，組織工程化神經移植組(TENC組)，自體神經移植組(Autograft組)，未手術對照組（Normal組）。
　　5.術后12周行再生神經大體觀察、免疫學檢測、電生理學檢測、形態(tài)學計量學分析。
　　結果：
　　1.成功分離及純化大鼠雪旺細胞

5、，經3次傳代后，基本無雜質細胞，純度較高；采用流式細胞儀分析結果表明第3代脂肪干細胞高表達CD29（91.81％）、CD90（88.22%）、CD73（99.78%）和 CD105（98.32%），低表達CD34（0.20%）和 CD45（0.72%）；雪旺細胞-脂肪干細胞共培養(yǎng)14天后可見原本呈梭形的脂肪干細胞以胞核為中心收縮，胞體折光性增強，胞體伸出多個長而粗的突起，同時雪旺細胞細胞體積增大、周圍突起增粗。免疫熒光染色檢測 MAP2

6、、NeuN和 GFAP不同程度陽性表達。
　　2.掃描電鏡可見組織工程化神經相通性好，在支架三維的孔隙中和表面上有許多神經元樣細胞生長且伸出長的突起黏附于支架，細胞生長狀況良好。支架最大和平均彈性模量分別為10.8±0.3 MPa，8.14±0.2 MPa。該彈性模量的大小完全可以抵抗移植后肌肉所產生的張力。
　　3.各組實驗動物都不同程度上實現(xiàn)缺損神經的再生修復。但從實驗動物神經修復效果來講，組織工程化神經移植組和自體神經

7、移植組都較為相似，都優(yōu)于單純絲素/膠原蛋白支架移植組。
　　結論：
　　1.雪旺細胞與脂肪干細胞共培養(yǎng)，兩者不僅能夠共生，而且雪旺細胞能顯著促進脂肪干細胞向神經元樣細胞分化。
　　2.絲素、膠原作為兩種優(yōu)異的天然可降解材料，以合適的配比混合，集足夠的力學性能、良好的生物相容性及適宜的降解性于一體，為組織工程化神經提供理想的載體。
　　3.絲素/膠原蛋白神經支架聯(lián)合雪旺細胞-脂肪干細胞共培養(yǎng)所構建的組織工程化神經具