IL-1RA-PEP融合蛋白功能及對缺血性再灌注腦損傷的治療作用研究.pdf

1、缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke)是由于腦部血液循環(huán)障礙而引起的腦組織損傷疾病。缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）是卒中治療過程中存在的主要損傷形式，危害極大且預(yù)后不良。目前尚無療效好，安全性高的藥物。
　　炎癥反應(yīng)伴隨缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展過程，IL-1是其中的一種重要炎癥因子，其在缺血再灌注后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。IL-1RA是天然抗炎因

2、子，能拮抗IL-1信號(hào)傳遞，阻斷其下游炎癥介質(zhì)的合成和發(fā)揮作用。研究表明，IL-1RA對于腦缺血性損傷，創(chuàng)傷性腦損傷和蛛網(wǎng)膜出血等腦血管疾病，均具有一定的治療作用，但療效不顯著，其主要原因是血腦屏障（BBB）限制了IL-1RA有效地進(jìn)入到腦組織炎癥損傷部位。
　　近年來，基于細(xì)胞滲透肽(CPPs)技術(shù)發(fā)展了一種非入侵輸送大分子穿透細(xì)胞膜的方法，它可以攜帶大分子滲透一些生物膜結(jié)構(gòu)，包括皮膚和血腦屏障等，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PEP-1，

3、兩性多肽，是細(xì)胞滲透肽的一種，目前已被廣泛應(yīng)用與輸送大分子到不同的組織器官。因此PEP-1的應(yīng)用可能為IL-1RA提供了一種新的臨床機(jī)遇，特別是為其更有效地拮抗腦缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)提供了可能性。
　　本研究將IL-1RA和PEP-1的功能進(jìn)行了融合，首次構(gòu)建了IL-1RA-PEP融合基因，在原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，表達(dá) IL-1RA-PEP融合蛋白占全菌總蛋白的30％以上。采用陰、陽離子交換層析和分子篩層析對融合蛋白

4、進(jìn)行了純化，獲得了純度為95%的 IL-1RA-PEP融合蛋白。EL4細(xì)胞學(xué)活性研究表明IL-1RA-PEP具有拮抗IL-1α的生物學(xué)活性，且其拮抗能力要優(yōu)于IL-1RA；同時(shí)，熒光定位顯示IL-1RA-PEP具有穿透上皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞膜的能力，且主要聚集在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。
　　應(yīng)用線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷模型（MCAo），靜脈注射IL-1RA-PEP融合蛋白，24小時(shí)后分析其滲透大鼠腦組織的效率，以及其抑制腦組織炎癥反應(yīng)的

5、能力。結(jié)果顯示，IL-1RA-PEP有效地滲透了缺血再灌注后大鼠腦組織，降低了大鼠腦組織梗死體積，減輕了腦水腫，改善了大鼠神經(jīng)缺陷評分，大鼠血清和腦組織中炎癥性因子含量下降，腦組織中巨噬細(xì)胞侵潤減輕，中性粒細(xì)胞活化的數(shù)量減少。
　　初步分析IL-1RA-PEP融合蛋白對腦缺血再灌注損傷的治療機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1RA-PEP能夠顯著調(diào)節(jié)NF-ΚB信號(hào)通路，通過下調(diào)NF-ΚB通路，抑制了炎癥性因子的表達(dá)，及炎性細(xì)胞的侵潤和活化，對

6、缺血再灌注繼發(fā)性炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。
　　綜上所述，1）構(gòu)建了 IL-1RA-PEP融合基因，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)，純化制備了IL-1RA-PEP融合蛋白，且其具有拮抗 IL-1的生物學(xué)活性和滲透上皮細(xì)胞膜的能力；2）證明了IL-1RA-PEP對腦缺血再灌注具有較好的保護(hù)性作用，其能有效的減少腦梗死，減輕腦水腫，降低神經(jīng)缺陷，抑制腦組織繼發(fā)性炎癥反應(yīng)；3）探究了IL-1RA-PEP主要是通過調(diào)控NF-ΚB信號(hào)通路，從而對腦缺血再灌