肺炎鏈球菌PepO依賴miR-155和TLR2增強巨噬細胞的吞噬能力.pdf

1、目的：了解細菌蛋白對免疫細胞的作用效應是評價其是否能用于抵抗細菌感染的重要依據(jù)。PepO是一種細菌中保守存在的肽鏈內切酶類蛋白，其缺陷菌株粘附和侵襲能力較野生菌株明顯減弱，是肺炎鏈球菌中一個新毒力因子。我們的研究顯示PepO有強烈的肺部致炎作用，但其導致的免疫效應和具體機制尚不清楚。肺泡巨噬細胞在宿主防御呼吸道細菌感染中發(fā)揮著重要作用，肺部對肺炎鏈球菌的清除始于巨噬細胞，因此本研究擬以巨噬細胞為研究對象，探究PepO對巨噬細胞的作用效應

2、及相關機制。
　　方法：經(jīng)典吞噬實驗觀察PepO刺激腹腔來源的巨噬細胞后其吞噬能力的改變；Q-PCR檢測PepO誘導巨噬細胞的miR-155、SHIP1 mRNA的表達變化；Western blot檢測PepO誘導巨噬細胞的SHIP1、AKT、NF-kB蛋白表達變化；轉染miR-155的mimic或inhibitor，以過表達或降低該基因的胞內水平，檢測巨噬細胞的吞噬能力改變和SHIP1 mRNA表達水平的變化；采用信號通路抑制劑

3、聯(lián)合PepO處理巨噬細胞，Q-PCR檢測miR-155的表達；采用熒光素酶報告基因檢測miR-155靶向SHIP1的熒光素酶活性；采用免疫熒光檢測巨噬細胞對細菌的吞噬能力改變，表面受體CR3表達情況，及NF-kB核轉位的變化。
　　結果：PepO處理巨噬細胞后，細胞對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的吞噬能力增強，呈劑量和時間依賴性。Q-PCR結果顯示，PepO刺激巨噬細胞后，其miRNA-155的表達較對照組顯著升高，呈劑量和時間依賴

4、性。轉染miRNA-155抑制劑的巨噬細胞，PepO處理后其吞噬細菌的能力較轉染陰性對照的巨噬細胞顯著下調，而轉染miRNA-155的 mimic巨噬細胞的吞噬細菌能力較相應對照細胞顯著上升，提示PepO可通過誘導miRNA-155的表達促進巨噬細胞的吞噬能力。熒光素酶報告SHIP1基因檢測結果顯示，轉染miRNA-155的細胞其熒光素酶活性較對照細胞顯著升高，證明miRNA-155的確能靶向調控SHIP1基因表達。Q-PCR和West

5、ern bloting結果顯示，PepO誘導的巨噬細胞較對照細胞的SHIP1表達顯著下調，且呈劑量和時間依賴性。而轉染miRNA-155抑制劑的巨噬細胞，PepO處理后其SHIP1的mRNA表達水平較轉染陰性對照的巨噬細胞顯著下調，轉染miRNA-155 mimic的巨噬細胞，PepO處理后其SHIP1的mRNA表達水平較轉染陰性對照的巨噬細胞顯著上調，這些結果提示PepO可通過miRNA-155調控SHIP1的表達。CR3為巨噬細胞識

6、別細菌的受體之一，有文獻提示其表達受SHIP1的負調控，我們的免疫熒光檢測結果顯示，PepO處理巨噬細胞后其CR3較陰性對照組顯著升高。這些結果提示PepO可能通過誘導miRNA-155下調SHIP1表達，從而促進CR3表達增加而提高巨噬細胞的吞噬能力。將PepO分別處理TLR2缺陷小鼠來源的腹腔巨噬細胞和野生鼠的巨噬細胞，結果顯示TLR2缺陷鼠的巨噬細胞表達miRNA-155較野生鼠顯著降低，其SHIP1的表達水平不隨PepO刺激的時

7、間延長而降低，同時其CR3的表達水平也不像野生鼠的巨噬細胞，因PepO的刺激而顯著增高。抑制劑實驗結果顯示，Akt和NF-κB的抑制劑處理細胞后， PepO刺激的miRNA-155表達較未處理組顯著下調。PepO刺激后巨噬細胞的Akt磷酸化水平顯著增高， NF-κB的含量及入核量顯著增加，而TLR2缺陷鼠的巨噬細胞在受到PepO刺激后，仍存在Akt磷酸化水平增高，但NF-κB的含量及入核量無顯著改變，這些結果提示PepO主要依賴于TLR