甘丙肽重構基因GAL(intronⅡ)的克隆以及甘丙肽小鼠NA神經(jīng)元特異表達轉(zhuǎn)基因載體的構建.pdf

1、目的：
　　 甘丙肽(galanin，GAL)是1983年發(fā)現(xiàn)的一種29氨基酸的神經(jīng)肽(人甘丙肽為30個氨基酸)，廣泛存在于許多物種的神經(jīng)系統(tǒng)，在人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與許多經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)共存。當前的研究表明，GAL在許多生理和病理過程如學習和記憶、焦慮、癲癇癥、AD癥、抑郁、痛覺、高泌乳血癥等中都起到重要作用。GAL在不同的組織中表達以及表達量的變化與不同功能和功能障礙相關。人多巴胺-β-羥化酶基因(dopamine-beta-hy

2、droxylase,hDBH)啟動子是一個研究的較為成熟的神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達啟動子，能夠調(diào)控外源基因在去甲腎上腺素能神經(jīng)元(noradrenalin(NA)neurons)表達。為了進一步研究GAL的生物學功能，闡明其在多種生理病理中的作用機制，為今后的基因治療提供新思路。本研究利用基因工程的方法構建pSP73/hDBH-promoter/GAL(intronⅡ)載體。為制備轉(zhuǎn)基因小鼠，研究GAL的功能提供一個新的工具。
　　

3、方法：
　　 通過常規(guī)PCR高保真擴增出hDBH基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.2kb的啟動子序列，兩端加上EcoRⅠ,SalⅠ限制性內(nèi)切酶位點克隆至pMD18-T Vector，構建重組載體pMD18-T Vector/hDBH-promoter，酶切鑒定無誤后進行測序。通過RT-PCR擴增出cDNA編碼區(qū)的序列，通過常規(guī)PCR分別從基因組中擴增出cDNA的5'和3'端非編碼序列，使用重疊延伸PCR(overlap extention

4、 PCR,OE-PCR)方法將三個片段重疊擴增獲得全長cDNA序列；將全長cDNA從第三外顯子第15個堿基處分成兩部分，分開的cDNA前半部分和后半部分以及第二內(nèi)含子(intronⅡ)再次進行重疊延伸獲得重構分子GAL(intronⅡ)：插入了第二內(nèi)含子的GAL全長基因cDNA，將GAL(intronⅡ)連入pMDI9-T simple載體，獲得重組載體pMDI9-Tsimple/GAL(intronⅡ)，酶切鑒定無誤后進行測序；以Ec

5、oRⅠ，SalⅠ雙酶切重組載體pMD18-TVector/hDBH-promoter和空載體pSP73后將hDBH啟動子克隆到pSP73上，構建重組質(zhì)粒pSP73/hDBH-promoter，再以SalⅠ，HindⅢ從pMD19-T Simple Vector/GAL(intronⅡ)切下GAL(intronⅡ)克隆到重組質(zhì)粒pSP73/hDBH-promoter下游，得到轉(zhuǎn)基因載體pSP73/hDBH-promoter/GAL(int

6、ronⅡ)，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，XhoⅠ酶切鑒定，得到約2.7kb目的條帶與預期結果一致，進行測序。
　　 結果：
　　 PCR擴增得到片段的測序結果與Gene Bank收錄的hDBH(序列號NT035014.4)、GALcDNA(序列號NM010253.3)、GAL基因(序列號NT082868.6)，進行同源性分析顯示同源性均達99％，重組片段的測序結果通過Clustalw比對軟件與理論上的重組序列比對證明重組質(zhì)