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文檔簡介
1、第一部分 BMP9在不同病理模型鼠及人肝臟中的表達差異
目的:
探討在NAFLD病人、高脂喂養(yǎng)小鼠及db小鼠肝臟中BMP9mRNA和蛋白的表達情況。
方法:
普食喂養(yǎng)(ND)和高脂喂養(yǎng)(HFD)23周的C57BL/6J小鼠各10只、正常人和NAFLD病人、同齡db鼠和野生鼠取肝臟提蛋白和RNA,再經(jīng)Q-PCR和Western blot檢測BMP9 mRNA和蛋白的表達差異。
結(jié)果:
2、> BMP9 mRNA和蛋白表達量在HFD小鼠、NAFLD病人和db小鼠肝臟中均顯著低于(P<0.01)相應(yīng)對照組。
結(jié)論:
BMP9基因的表達可能與機體脂代謝相關(guān)。
第二部分 BMP9表達上調(diào)對飽和脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯的影響
目的:
探討B(tài)MP9表達上調(diào)對飽和脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯聚集情況的影響
方法:
在人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞2,利用
3、飽和脂肪酸FFAs(OA:PA=2:1混合)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性細(xì)胞模型,根據(jù)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的多少及細(xì)胞狀態(tài)確定合適的 FFAs的作用濃度。同時,利用BMP9過表達腺病毒(Ad-BMP9)過表達BMP9的表達,通過油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的測定來檢測BMP9基因?qū)FAs誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集是否有影響。
結(jié)果:
在人HepG2肝癌細(xì)胞中,成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型。根據(jù)油紅O染色結(jié)果確定了FFAs的最適作用濃度為
4、0.25mM;根據(jù)細(xì)胞中熒光表達情況及BMP9 mRNA和蛋白表達情況確定BMP9成功過表達;BMP9 mRNA的表達隨著FFAs濃度的增加呈下降趨勢,與0mM時比較,0.25mM FFAs時BMP9的表達明顯降低(P<0.01)。與Ad-GFP組比較,Ad-BMP9組在FFAs誘導(dǎo)的狀態(tài)下脂滴明顯減少(P<0.01),TG的含量顯著降低(P<0.01)。
結(jié)論:
BMP9基因表達上調(diào)可以減少甘油三酯的聚集。
5、 第三部分 BMP9過表達對甘油三酯代謝調(diào)節(jié)的可能機制
目的:
探討B(tài)MP9在脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性中對甘油三酯代謝調(diào)節(jié)的分子機制。
方法:
在人HepG2肝癌細(xì)胞中,過表達BMP9基因,加入0.25mM FFAs誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性后,通過Q-PCR和Western blot檢測脂肪酸從頭合成相關(guān)基因(SREBP1C、FAS、SCD-1、ACC-1)的 mRNA和蛋白的表達;分析信號通路AM
6、PK的變化情況;利用細(xì)胞免疫熒光實驗研究 BMP9在細(xì)胞中表達的部位;利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測BMP9基因?qū)REBP1C基因啟動子的調(diào)控作用,并尋找可能的結(jié)合位點。
結(jié)果:
與Ad-GFP組相比,Ad-BMP9組在FFAs誘導(dǎo)的狀態(tài)下脂肪酸從頭合成相關(guān)基因(SREBP1C、FAS、SCD-1、ACC-1)的mRNA表達均顯著降低(P<0.01);FAS、SCD-1、SREBP1C蛋白表達顯著降低(P<0.01
7、);ACC和AMPK的蛋白的磷酸化水平均顯著增加(P<0.01);而AMPK的總蛋白水平明顯降低(P<0.01)。細(xì)胞免疫熒光實驗證明BMP9在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達,但細(xì)胞漿中表達較強,核內(nèi)略弱;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明BMP9基因可顯著下調(diào)SREBP1C基因啟動子的活性(P<0.05);將啟動子截斷后進一步分析發(fā)現(xiàn),BMP9基因調(diào)控SREBP1C基因啟動子的結(jié)合區(qū)域可能位于SREBP1C基因啟動子-212至-381之間,結(jié)合
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