鹽脅迫對(duì)花生膜脂組分及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、本文以含油量豐富的花生品種魯花14為試驗(yàn)材料來(lái)研究在鹽脅迫及恢復(fù)處理下花生幼苗的生理特性。并對(duì)不同處理的花生幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)分析測(cè)序結(jié)果找出與膜脂組分變化相關(guān)的關(guān)鍵基因。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艦榱擞^察鹽脅迫及復(fù)水處理對(duì)花生幼苗生理指標(biāo)的影響，對(duì)250mM NaCl處理4天（S4）及復(fù)水3天（R3）的花生幼苗進(jìn)行生理指標(biāo)（熒光參數(shù)，膜脂組成，活性氧及抗氧化酶等）的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，在250 mM NaCl處理時(shí)，花生

2、幼苗的生長(zhǎng)受到明顯抑制?；ㄉ~片的不飽和脂肪酸含量，不飽和度（DBI），F(xiàn)v/Fm，抗氧化酶活性，ΦPSII明顯下降。其中亞麻酸含量（18:3）下降了42.5％，而Fo和NPQ卻明顯升高。然而，在恢復(fù)處理時(shí)，花生幼苗的不飽和脂肪酸含量（18:3）及不飽和度（DBI）略有升高。Fv/Fm，ΦPSII及抗氧化酶（APX，SOD）活性也有所上升。O2??和H2O2的含量有所下降。然而，在恢復(fù)處理時(shí)PSI的活性卻沒(méi)有明顯變化。根據(jù)這些結(jié)果我們推

3、測(cè)，在250 mM鹽處理時(shí)，花生幼苗各種生理指標(biāo)的下降可能與不飽和脂肪酸含量及不飽和度（DBI）的下降有關(guān)?；ㄉ~片不飽和脂肪酸含量的降低引起了細(xì)胞膜穩(wěn)定性的下降。細(xì)胞膜穩(wěn)定性的下降導(dǎo)致了PSII對(duì)鹽脅迫耐受性的降低，使實(shí)際光化學(xué)效率降低，過(guò)剩光能大量積累，引起光抑制。光抑制又會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，最終產(chǎn)生氧化脅迫。然而，恢復(fù)條件下不飽和脂肪酸含量的升高可能有利于緩解鹽脅迫對(duì)花生幼苗的光抑制。
　?、茖?duì)三葉一心階段的花生幼苗進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)

4、液處理4天（CK），鹽處理四天（S4），恢復(fù)3天（R3，鹽處理四天后復(fù)水3天處理）處理后取材提RNA并選取質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)共獲得總reads數(shù)135,144,930。通過(guò)整理，組裝去除低質(zhì)量的reads，最終獲得的clean reads數(shù)為131,459,048。這些clean reads的Q20（1%的錯(cuò)誤率）達(dá)到80.02%。說(shuō)明這些測(cè)序結(jié)果是合格的。通過(guò)對(duì)獲得的clean reads進(jìn)行差

5、異性分析，最終結(jié)果表明，在CK-VS-S4（以下簡(jiǎn)稱(chēng)鹽處理）有1742個(gè)基因差異表達(dá)。其中，有898個(gè)基因上調(diào)，844個(gè)基因下調(diào)。而在 S4-VS-R3（以下簡(jiǎn)稱(chēng)恢復(fù)處理）處理組，有390個(gè)基因差異表達(dá)。其中323個(gè)基因上調(diào)，67個(gè)基因下調(diào)。在這些差異基因中我們選取了12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明我們的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)可以用來(lái)進(jìn)行深入分析。通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行GO及KEGG分析，我們篩選到兩

6、個(gè)與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的關(guān)鍵基因（CL8534.Conting6, CL8534.Conting7），這兩個(gè)基因都編碼ω-3脂肪酸去飽合酶，在鹽處理?xiàng)l件下這兩個(gè)關(guān)鍵基因下調(diào)表達(dá)，而在恢復(fù)處理?xiàng)l件下上調(diào)表達(dá)。因此，我們初步推測(cè)在恢復(fù)處理?xiàng)l件下花生葉片中不飽和脂肪酸含量的升高可能與這些關(guān)鍵基因的上調(diào)有關(guān)。關(guān)鍵基因的上調(diào)，引起了不飽和脂肪酸含量的改變，使細(xì)胞膜的穩(wěn)定性有所增加，細(xì)胞膜穩(wěn)定性的增加對(duì)鹽脅迫引起的光抑制起到了一定的緩解作用。

7、r>　?、菂⒖嫁D(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的ω-3脂肪酸去飽和酶基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)序列。最終克隆出基因長(zhǎng)度為1199 bp（總長(zhǎng)2227）的中間序列。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列與花生ω-3脂肪酸去飽和酶基因序列的相似度為100%，說(shuō)明該基因片段確實(shí)是ω-3脂肪酸去飽和酶基因的中間片段。通過(guò)對(duì)已克隆出的中間片段進(jìn)行不同時(shí)間不同濃度鹽處理的基因表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)及鹽濃度的升高，該基因片段的表達(dá)量都有所下降。但是