替卡西林鈉及其制劑的質量控制方法與藥物動力學研究.pdf

1、替卡西林是一種新的噻烯羧基青霉素，為半合成的抗假單胞菌青霉素，其抗菌譜和藥理學特性與羧芐西林類似，通過干擾粘肽交叉聯結而影響細菌細胞壁的合成，引起細胞壁的缺陷或薄弱，導致細菌畸形，繼以迅速溶解死亡，從而達抗菌作用。替卡西林對革蘭氏陽性菌的抑菌作用低于青霉素G；對革蘭氏陰性菌的抑菌作用較羧芐西林強數倍。銅綠假單胞菌易對本品耐藥。由于革蘭陽性菌和陰性菌都能產生β-內酰胺酶，此類酶能在青霉素類藥物作用于病原體之前發(fā)揮作用并將其破壞，從而降低其

2、療效?？死S酸鉀對多種β-內酰胺酶均是一種強有力的抑制劑，因此，它與替卡西林鈉組成的復合劑型注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀，抗菌活性更強，抗菌譜更廣。該制劑是由葛蘭素史克公司最早研制成功的，商品名為泰門汀。近年來，有文獻報道該制劑對治療老年社區(qū)獲得性肺炎（CAP）有明顯的療效，而且非發(fā)酵菌（NFGNB）對其耐藥性也低。
　　目前，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版中未收載該品種的原料藥及制劑，現行標準均為企業(yè)由

3、國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的申報藥品標準，而且各企業(yè)的質量標準在項目設置和限度規(guī)定上都存在一些問題，不能有效控制產品的質量。
　　本研究首先建立了同時測定替卡西林鈉及其制劑中主成分及有關物質含量的HPLC分析方法，該方法的應用可對替卡西林鈉及其制劑中雜質的加以嚴格控制，對主成分的含量進行準確可靠地檢測，充分提高了該藥品的質量控制水平；建立了HPSEC法測定替卡西林鈉及其制劑中高分子化合物的含量，該方法對嚴格控制β-內酰胺類抗生素中

4、高分子化合物的含量有著重要的意義；還建立了同時測定樣品中7種殘留溶劑的GC分析方法，并采用GC-MS的分析方法對其它未知揮發(fā)性雜質進行結構鑒定及含量測定；比較了不同替卡西林鈉原料藥來源（即不同R、S比例的替卡西林）的替卡西林制劑在抗菌活性和急性毒性方面的差異；本研究還建立了靈敏度高，專屬性強，分析速度快的UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠血漿樣品中的主成分的含量，并將該方法應用于大鼠靜脈注射給藥后的藥物動力學研究，為注射用替卡西

5、林鈉克拉維酸鉀的臨床應用提供了新的參考依據。
　　第一部分：HPLC法同時測定替卡西林鈉及其制劑中的主成分及有關物質的含量
　　目的：建立同時測定替卡西林鈉及注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中主成分及有關物質的HPLC方法。對2家生產企業(yè)的6批替卡西林鈉和4家生產企業(yè)的12批注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中主成分及有關物質的含量進行測定；對8家生產企業(yè)共37批次抽驗樣品注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀制劑的質量進行考察，并對其檢測結果進行分

6、析和評價。
　　方法：采用Waters XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱；有關物質檢查以0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（pH7.0）為流動相A，0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（pH7.0）-甲醇（50:50）為流動相B，梯度洗脫；含量測定以0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（用磷酸調節(jié)pH值至7.0）-甲醇（80:20）為流動相，等度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220

7、nm；柱溫為30℃。
　　結果：有關物質檢查中的梯度洗脫法具有更強的分析雜質的能力，樣品中各成分的分離度及檢測靈敏度均滿足有關物質測定要求。替卡西林雜質 A及破壞條件下產生的降解雜質峰與主成分峰分離較好；替卡西林在19.52~1561.76μg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r2=0.9999）；克拉維酸在1.22~121.79μg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r2=0.9998）；替卡西林與克拉維酸的平均加

8、樣回收率均為99.8％，相對標準偏差（RSD）分別為0.4%、0.7%（n＝9）。替卡西林的檢測限（LOD）為0.24μg/mL，克拉維酸的檢測限（LOD）為0.19μg/mL；替卡西林雜質 A、其它最大雜質和總雜質含量的重復性的RSD均小于1.0%；替卡西林和克拉維酸的日內、日間精密度的RSD均小于1.1%；供試品溶液于12 h內低溫條件下比較穩(wěn)定，但在室溫條件下穩(wěn)定性差。原料藥與制劑樣品中替卡西林雜質A的含量均小于1.5%，最大單一

9、雜質的含量均小于2.0%，總雜質的含量均小于4.0%。替卡西林和克拉維酸的含量按無水物計算，替卡西林含量測定結果分布于79.7%~85.4%之間，克拉維酸含量測定結果分布于5.1%~5.8%。
　　結論：本研究建立了HPLC法測定替卡西林鈉及其注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中主成分及有關物質的含量，該方法靈敏度高、專屬性強、重現性好，可用于替卡西林鈉及其制劑的質量控制。
　　第二部分：HPSEC法分離測定替卡西林鈉及其制劑中的高

10、分子化合物
　　目的：建立高效分子排阻色譜（HPSEC）法測定替卡西林鈉及其制劑中的高分子化合物的分離分析方法。應用該法對2家生產企業(yè)的6批替卡西林鈉原料藥和4家生產企業(yè)的12批注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中的高分子化合物進行測定。對8家生產企業(yè)37批次抽驗樣品注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀制劑的質量進行評價，并其結果進行統(tǒng)計學分析。
　　方法：采用TSKGEL G2500PWXL凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，5μm）；

11、流動相為pH7.0的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液[取0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61:39）]；流速為0.6 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為室溫。通過化學反應方法對高分子化合物進行驗證，采用柱切換技術將凝膠色譜峰在反相色譜系統(tǒng)中進行定位，并與SephadexG-10凝膠色譜柱所測定的高分子化合物進行定性比較，來判定方法的可行性。
　　結果：替卡西林與其高分子化合物的色譜

12、峰可達到基線分離（分離度為2.27），高分子化合物峰的理論板數為6000左右且對稱性良好（對稱性為0.90），分析時間短，20 min內即可完成。替卡西林濃度在0.50~40.16μg/mL范圍內，與峰面積呈良好的線性關系（r=0.9999，n=7）；LOQ為3.60μg/mL，LOD為1.15μg/mL；日內、日間精密度的RSD均小于3.5%。通過化學反應方法、柱切換技術驗證并確定了該雜質，與SephadexG-10凝膠色譜柱所測定高

13、分子化合物的方法相比，本研究所使用的TSKGEL G2500PWXL凝膠色譜柱可實現更高的柱效和更快的分析速度。
　　結論：本研究建立了使用TSKGEL G2500PWXL凝膠色譜柱對替卡西林鈉及其制劑中的高分子化合物進行檢測。該方法操作簡單,專屬性強,靈敏度高，可以用于β-內酰胺類抗生素中高分子化合物的控制，對減少該類藥品的在臨床上的過敏反應具有十分重要的意義。
　　第三部分：采用GC和GC-MS法同時測定替卡西林鈉及其制

14、劑中的揮發(fā)性雜質
　　目的：建立頂空氣相色譜法同時測定替卡西林鈉及其制劑中的甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯等7種殘留溶劑的含量，并采用氣相色譜-質譜聯用技術，結合質譜數據檢索對樣品中的未知揮發(fā)性雜質進行結構鑒定及含量測定。
　　方法：GC條件：色譜柱為DB-624毛細管柱（30 m×0.25 mm，1.40μm）；柱溫采用程序升溫：40℃保持5 min，以10℃/min的速率升至200℃，保持4 min；氫火

15、焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度250℃；分流進樣，分流比：10:1；進樣口溫度：200℃；載氣：氮氣，流速：5.0 mL/min；頂空進樣，平衡溫度：85℃，平衡時間：30 min。GC-MS條件：色譜條件：除載氣為氦氣（He）、流速為1.0 mL/min外，其余條件同GC條件。質譜條件：離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；接口溫度：230℃；溶劑切割時間：4 min；四極桿溫度150℃；采用電子轟擊離子化（EI源）；電離

16、方式：電子能量70 eV；掃描方式：Full scan；掃描范圍：m/z30~500；檢測時間：3.00~25.00 min。
　　結果：7種殘留溶劑之間的分離度良好，理論板數分別以其待測成分的色譜峰計算均不低于5000；甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯的線性范圍分別為1.53~610.24μg/mL、2.55~1020.76μg/mL、2.55~1020.96μg/mL、2.56~1014.96μg/mL、2.53

17、~1013.24μg/mL、0.86~342.72μg/mL、2.57~1026.76μg/mL（r2≥0.9983）；平均回收率為89.2％~105.4％，RSD在2.2％~4.5％之間；LOQ≤2.57μg/mL；精密度的RSD≤2.3%；供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。2家生產企業(yè)的6批原料藥與4家生產企業(yè)的12批制劑中7種有機溶劑的殘留量均符合《中國藥典》2015年版中對殘留溶劑限量的相關規(guī)定。生產企業(yè)C與生產企業(yè)F、生產企業(yè)

18、D與生產企業(yè)E的替卡西林鈉原料藥分別來源于同一家生產企業(yè)且生產工藝相同。通過對樣品中未知揮發(fā)性雜質的檢測結果分析，生產企業(yè)C與生產企業(yè)F的樣品中含有乙酸丁酯，生產企業(yè)D與生產企業(yè)E的樣品中含有正丁醇、乙酸丁酯、二氯甲烷和2-乙基己酸。
　　結論：本研究建立了GC法同時測定替卡西林鈉及其制劑中7種殘留溶劑的含量，并采用GC-MS法對樣品中未知揮發(fā)性雜質的結構進行鑒定及含量測定。該方法操作簡便，準確度高，重現性好，在所考察的濃度范圍內

19、各組分線性關系良好,各色譜峰之間的分離度均符合要求。該方法為替卡西林鈉及其制劑的質量控制提供了重要依據。
　　第四部分：兩種原料來源的替卡西林制劑的抗菌活性及其急性毒性試驗比較
　　目的：建立抗生素微生物檢定法中的濁度法測定替卡西林的抗菌活性，并考察兩家不同原料來源的生產企業(yè)（替卡西林R、S異構體比例不同）的樣品中替卡西林抗菌活性的高低。通過對小鼠進行急性毒性試驗研究，比較兩家不同原料來源的生產企業(yè)的樣品間LD50范圍的差異

20、。
　　方法：取金黃色葡萄球菌為實驗菌懸液，濃度為2%~3%；一劑量法是用pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg/L的標準溶液，供試品溶液濃度為0.4 mg/L，繪制標準曲線，根據標準曲線計算供試品的效價；或選擇0.3 mg/L和0.6 mg/L為二劑量法測定濃度，計算供試品的效價。分別采用一劑量和二劑量法對替卡西林及其制劑中替卡西林的抗菌活性進行測定，并比較兩種不同替卡西林R、S比例的注射

21、用替卡西林鈉克拉維酸鉀的抗菌活性的高低。根據個體動物的體質量，依照0.4 mL/10 g的注射體積/體質量比，小鼠接受的注射液劑量為4 g/kg體重，每只小鼠注射0.5 mL。對照組動物注射相同體積比的生理鹽水。注射速度約為0.2 mL/90 s，單只動物的注射時間約為3 min。觀察72 h內小鼠的生長及死亡情況，并用Bliss法計算半數致死量（LD50），比較兩種不同替卡西林R、S比例的注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀的急性毒性的大小。<

22、br>　　結果：替卡西林濃度在0.1~1.6 mg/L范圍內，吸光度值A與抗生素濃度的對數成良好的線性關系，相關系數r2=0.9996；平均回收率為98.1%， RSD為1.3%；日內、日間精密度的RSD分別為0.7%、1.1%。由替卡西林原料藥及制劑的效價測定結果顯示，生產企業(yè)C中替卡西林的效價值略高于生產企業(yè)D。依不同給藥劑量經小鼠尾靜脈注射注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀后，與溶劑對照組動物相比，樣品處理組動物會不同程度的出現異常反應、

23、體質量下降和死亡的情況。LD50范圍分別為：生產企業(yè)C為4.62~5.72 g/kg體重，生產企業(yè)D為3.42~4.30 g/kg體重。
　　結論：該方法不僅適用于對替卡西林原料藥抗菌活性的考察和急性毒性的研究，還可以對來自不同生產企業(yè)、含有不同替卡西林R、S比例的注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀的抗菌活性和急性毒性進行比較，為臨床安全用藥提供了參考依據。
　　第五部分：UPLC-ESI-MS/MS法測定大鼠靜脈注射替卡西林制劑后

24、血漿中的主成分及藥物動力學研究
　　目的：建立一種同時測定大鼠血漿中替卡西林和克拉維酸該2種主成分含量的UPLC-ESI-MS/MS方法，成功的應用于大鼠靜脈注射給予注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀后血漿中替卡西林R、S異構體和克拉維酸的藥物動力學研究，并建立其藥-時曲線，闡明藥動學參數與特征。
　　方法：大鼠靜脈注射給予注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀（500 mg/kg）后，分別于給藥后0.08，0.25，0.5，0.75，1，2，

25、4，6，9，12，18，24和48 h眼內眥靜脈叢取血，制備血漿樣品，采用乙腈直接沉淀蛋白法進行樣品預處理，甲苯磺丁脲為內標。色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7?m）；柱溫為30℃；流動相為A（0.1%甲酸水溶液， v/v）-B（0.1%甲酸乙腈溶液，v/v），采用梯度洗脫方式，梯度洗脫程序如下：0.0-1.00 min，80%-10%A；1.00-1.20 min，10%A等度洗脫

26、；1.20-1.21 min，10%-80%A；1.21-1.50 min，80%A等度洗脫。每次進樣前預平衡1 min。流速為0.6 mL/min。色譜柱后溶液無分流，全部進入離子源，總體分析時間3 min，進樣量2μL。質譜條件：電噴霧離子源（ESI源），StepWave?離子源，離子源溫度（Source Temp）為150℃，毛細管（Capillary）電壓為2.0 kV，離子源補償電壓（Source Offset）為50 V，脫

27、溶劑氣溫度（Desolvation Temp）為500℃，脫溶劑氣（Desolvation）流量為800 L/Hr，錐孔氣（Cone）流量為150 L/Hr，霧化氣（Nebuliser）壓力我7.0 Bar，接口處加熱，采用多反應監(jiān)測模式（MRM）。待測化合物和內標物的監(jiān)測離子對分別為：替卡西林R（m/z385.2/160.2）、替卡西林S（m/z385.2/204.2）、克拉維酸 m/z197.9/136.0和甲苯磺丁脲 m/z271

28、.1/91.1。
　　結果：血漿中替卡西林R（m/z385.2/160.2）在30-10000 ng/mL范圍內，線性關系良好（r2=0.9967），替卡西林S（m/z385.2/204.2）在10~10000 ng/mL范圍內，線性關系良好（r2=0.9961），克拉維酸在30~10000 ng/mL范圍內，線性關系良好（r2=0.9981），最低定量限（LLOQ）≤10.0 ng/mL。日內、日間精密度的RSD均小于4.3%，

29、相對誤差（RE）為-4.7%~5.0%。平均提取回收率為86.9%~96.4%。大鼠靜脈注射注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀后，血漿中替卡西林兩差向異構體和克拉維酸等待測成分在大鼠體內的藥物動力學藥-時曲線有所差異?？傮w來說，大鼠靜脈注射注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀后，替卡西林兩差向異構體和克拉維酸在體內吸收均較迅速，替卡西林（m/z385.2/204.2）和克拉維酸具有相近的消除速率。替卡西林（m/z385.2/160.2）的消除速率較慢。<