NaCl對M1型巨噬細胞極化的調控及其機制研究.pdf

1、目的：研究高鹽對M1型巨噬細胞極化的調控，并在內毒素休克炎癥疾病模型中得到驗證，這為臨床一些疾病的干預和治療提供了理論依據(jù)，同時為我們下一步探究其機制打好堅實的基礎。
　　方法：⑴用GM-CSF誘導小鼠骨髓來源的原代巨噬細胞(BMDMs)，在加入LPS（200 ng/ml）和IFN-γ(10 ng/ml)之前，用不同濃度的NaCl預處理BMDMs2小時。用CCK8檢測細胞活力的方法檢測不同濃度的NaCl對M1型巨噬細胞的活力的影響

2、，確定一個合適的高鹽濃度用于后續(xù)的實驗。用該合適的高鹽濃度預處理BMDMs，分別在處理后的6、12和24h收取細胞培養(yǎng)上清，用ELISA檢測M1型巨噬細胞因子IL-6和IL-12p40的表達。用不同濃度的NaCl(5、10和20 mM)預處理BMDMs，24小時后，收取細胞并提取總RNA，RT-PCR檢測IL-6和IL-12p40在mRNA水平的表達。流式細胞術檢測胞內抗體IL-12p40的平均熒光強度。流式細胞術檢測M1型巨噬細胞表面

3、標記CD86和MHCⅡ的表達。Western Blot檢測IRF5蛋白的表達。⑵成功誘導BMDMs，將細胞分為兩組，其中一組用NaCl預處理6小時，另外一組細胞不做任何處理，收取細胞，使其濃度為1×107/ml。將20只老鼠分為兩組，每組10只，分別將200μl上述兩組細胞腹腔注射入小鼠體內。24小時后，每只小鼠腹腔注射800μg的LPS，觀察小鼠死亡率。24小時后，每只小鼠腹腔注射200μg的LPS，12小時后小鼠眼球取血，斷頸處死小

4、鼠，抽取腹腔細胞，獲得小鼠肺、肝臟和脾。病理切片H&E染色顯示小鼠肺和肝臟的損傷情況。ELISA檢測小鼠血清中IL-6和IL-12p40的表達。RT-PCR檢測小鼠腹腔和脾細胞中IL-6和IL-12p40在mRNA水平的表達。
　　結果：①高濃度的NaCl(≥40 mM)減弱了M1型巨噬細胞的活力。合適的高鹽濃度為20mM，該濃度不會隨著時間的增加影響細胞活力。②ELISA結果顯示，NaCl預處理后，IL-6和IL-12p40的表

5、達顯著降低，并且具有時間和劑量的依賴性。③RT-PCR顯示，與對照組相比，NaCl預處理組IL-6和IL-12p40的表達明顯降低了，且具有劑量依賴性。④流式細胞術顯示，相對于正常組，NaCl預處理組IL-12p40的表達也顯著減少。⑤流式細胞術顯示，與正常組相比，NaCl預處理組M1型巨噬細胞表面標記CD86和MHCⅡ的表達并沒有明顯的變化。⑥Western Blot顯示，與對照組相比，NaCl預處理組IRF5的表達也顯著減少。⑦注射

6、NaCl預處理的BMDMs組小鼠的死亡率明顯降低。⑧H&E染色顯示，NaCl干預可明顯抑制LPS所致的肺和肝臟組織的損傷。⑨注射NaCl預處理的BMDMs小鼠體內，LPS所致的M1型巨噬細胞的極化明顯減少，其M1型巨噬細胞因子IL-6和IL-12p40的表達顯著減少。
　　結論：⑴NaCl可抑制體外M1型巨噬細胞的極化，其細胞因子IL-6和IL-12p40的表達顯著降低，其機制可能是NaCl減少了M1型巨噬細胞的轉錄因子IRF5的