幾種綠膿桿菌外毒素融合蛋白在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運路徑和furin蛋白酶切速率研究.pdf

1、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)是一種革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌屬產(chǎn)生的一種具有ADP核糖基化轉(zhuǎn)移酶功能的毒素蛋白,它通過特異性的將哺乳動物細胞內(nèi)的蛋白延長因子2進行不可逆的核糖基化作用而使之失活最終導(dǎo)致細胞死亡。對于這一毒素蛋白的細胞致死過程中復(fù)雜的細胞分子動力學(xué)過程也一直是人們探索的重點。
　　本研究通過構(gòu)建四種熒光蛋白標(biāo)記的綠膿桿菌外毒素A來對該毒素蛋白進入細胞的過程進行追蹤,以確定細胞

2、內(nèi)蛋白毒素進入量與時間的關(guān)系,通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方式研究毒素蛋白在胞內(nèi)經(jīng)由酶切的效率與時間的關(guān)系,并對毒素蛋白轉(zhuǎn)運以及酶切的位置進行了粗略的亞細胞定位。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值的變化對PEA毒素分子進入到細胞內(nèi)部速率并沒有很顯著的影響,而對毒素的毒性有增強作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特定信號序列KDEL則使毒素分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定細胞器聚集,這主要是因為天然毒素PEA的C段序列REDLK結(jié)合到了KDEL受體而最后被運送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
　　在PEA毒素內(nèi)

3、化的過程中需要被細胞內(nèi)的類furin蛋白酶將其從279～280的氨基酸之間切斷才能夠表現(xiàn)出后邊催化結(jié)構(gòu)域的活性,所以在探索這一酶切過程的酶切的效率和時間以及對酶切后的片段進行定位的需要,我們運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transferring,FRET)的方法設(shè)計了一個具有兩個熒光標(biāo)簽的PEA融合毒素蛋白,藍色熒光蛋白(Enhanced blue fluorecsent protein