PinX1基因靶向端粒酶抑制鼻咽癌干細胞及其TRFs調控機制的研究.pdf

1、鼻咽癌是中國南方地區(qū)及東南亞國家高發(fā)的惡性腫瘤之一，該類腫瘤的復發(fā)及遠處轉移是導致治療失敗及死亡的重要方式。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞是導致包括鼻咽癌在內的惡性腫瘤復發(fā)和耐藥的重要原因，目前已從多種惡性腫瘤中分選出腫瘤干細胞。腫瘤干細胞表現(xiàn)出一定的自身特性，如自我復制能力強，高表達端粒酶活性，具有CD133+、CD44+表面標志物等。這為進一步探討腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展及靶向腫瘤干細胞提供了新領域。本課題組曾開展了端粒酶抑制劑Pin

2、X1基因靶向鼻咽癌細胞端粒酶活性抑制鼻咽癌細胞的前期研究工作，在此基礎上，擬采用PinX1基因靶向鼻咽癌CD133+腫瘤干細胞，探討其對該腫瘤干細胞端粒酶活性下調、抑制腫瘤干細胞活性，并進一步探討端粒重復序列結合蛋白(TRF1及TRF2)的調控作用機制，闡明其在PinX1基因作用中的地位。
　　一.CD133+陽性鼻咽癌細胞具有腫瘤干細胞特征
　　目的:觀察以CD133+作為干細胞標志物分選CD133陽性細胞的增殖、遷移等能

3、力。
　　方法:鼻咽癌CNE2細胞通過免疫磁珠分選的方法獲得CD133+細胞和CD133-細胞，并通過流式細胞術對分選的效率進行驗證。然后將獲得的CD133+細胞和CD133-細胞進行干細胞球誘導及裸鼠體內成瘤，通過QPCR法檢測CD133+細胞和CD133-細胞中干細胞標志物SOX2、Nanog的表達。其次用CCK-8觀察兩株細胞的生長情況，通過Transwell法和劃線法觀察細胞遷移情況，通過Transwell法觀察細胞侵襲情

4、況。
　　結果:
　　1.以未加任何標記的CNE2細胞系為陰性對照，對常規(guī)培養(yǎng)3天的細胞表面的CD133和CD44的表達情況檢測發(fā)現(xiàn)，CD133+和CD133-細胞成功分選。
　　2.將新分選的CD133+和CD133-細胞，接種到含有bFGF、EGF、胰島素和B27無血清干細胞誘導培養(yǎng)基中，14天后，CD133+腫瘤細胞球的半徑顯著大于CD133-細胞。
　　3.通過QPCR檢測CD133+和CD133-細胞中

5、的Nanog和SOX2，Nanog和SOX2的mRNA在CD133+細胞中的表達量顯著高于CD133-細胞。
　　4.使用CCK-8法考察分選的CD133+和CD133-細胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)CD133+細胞增殖速度顯著快于CD133-細胞。
　　5.通過劃線實驗或Transwell法檢測CD133+和CD133-細胞的遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)CD133+細胞比CD133-細胞遷移、侵襲能力強。
　　6.該種CD133+鼻咽

6、癌干細胞比CD133-細胞群有較強的裸鼠成瘤能力。結論:采用CD133磁珠從鼻咽癌CNE2細胞中成功分選出CD133+鼻咽癌腫瘤干細胞，同時表達Nanog和SOX2及端粒酶活性，體外成球、增殖、遷移、侵襲能力及裸鼠成瘤等腫瘤干細胞特征明顯強于CD133-鼻咽癌細胞群。
　　二.PinX1基因靶向端粒酶抑制CD133+鼻咽癌干細胞
　　目的:探討PinX1基因對CD133+鼻咽癌干細胞增殖和遷移等活性的影響
　　方法:在

7、CD133+細胞中轉染PinX1過表達質粒及相應的空載質粒，在CD133-細胞中轉染PinX1siRNA及NC siRNA，將獲得細胞進行干細胞球誘導，用CCK-8觀察細胞的生長情況，通過Transwell法和劃線法觀察細胞遷移情況，通過Transwell法觀察細胞侵襲情況，通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況。
　　結果:
　　1.PinX1質粒轉染CD133+鼻咽癌干細胞后，能明顯下調該腫瘤干細胞端粒酶活性，
　　2.C

8、D133+細胞中轉染PinX1過表達質粒后，細胞增殖速度低于空載組;CD133-細胞中轉染PinX1siRNA后生長速度高于NC對照組。
　　3.CD133+細胞轉染PinX1過表達質粒后，干細胞球半徑顯著變小，細胞成球能力減弱;而CD133-細胞中轉染siRNA后，成球半徑略有增加，細胞成球能力略有增強。
　　4.CD133+細胞轉染PinX1過表達質粒后，細胞遷移、侵襲比例低于空載組;CD133-細胞轉染PinX1siR

9、NA后，細胞遷移、侵襲比例高于NC組。
　　5.CD133+細胞轉染PinX1過表達質粒后，細胞凋亡比例高于空載組;CD133-細胞轉染PinX1siRNA后，細胞凋亡比例低于NC組。
　　結論:PinX1能夠通過下調腫瘤干細胞中端粒酶活性抑制CD133+鼻咽癌干細胞的增殖和遷移、增加CD133+細胞的凋亡。
　　三.hTERT及TRFs在PinX1基因作用中的調控機制
　　目的:進一步探討hTERT及TRFs在

10、PinX1基因作用中調控作用機制
　　方法:通過QPCR檢測hTERT的表達檢測CD133+細胞中端粒酶的活性，并通過QPCR的方法檢測PinX1的表達。在CD133+細胞中轉染PinX1過表達質粒及相應的空載質粒，在CD133-細胞中轉染PinX1siRNA及NC siRNA，通過QPCR和WB方法觀察hTERT、PinX1、TRFs的表達。
　　結果:
　　1.CD133+細胞中PinX1表達量低于CD133-細胞

11、，而hTERT的在CD133+細胞中的表達量顯著高于CD133-細胞，表明CD133+細胞端粒酶活性比CD133-強。
　　2.成功構建了PinX1過表達質粒和siRNA，并通過QPCR和WB驗證了PinX1過表達質粒和siRNA在CNE2細胞中的成功影響了PinX1含量。
　　3.在CD133+細胞中轉染PinX1過表達質粒后hTERT表達量低于空載質粒，而TRF1高于空載組，在CD133-細胞中轉染PinX1siRNA，