題目一：ZEB1誘導的miR-99b-let-7e-miR-125a基因簇促進食管鱗癌侵襲和轉移題目二：USP39促進食管鱗癌的生長并且預測不良預后.pdf

1、本文從以下幾部分闡述了ZEB1誘導的miR--99b/let--7e/miR--125a基因簇促進食管鱗癌侵襲和轉移；USP39促進食管鱗癌的生長并且預測不良預后
　　第一部分 ZEB1誘導的miR-99b/let-7 e/miR-125a基因簇促進食管鱗癌侵襲和轉移
　　食管癌是世界范圍內最常見的消化道腫瘤之一，食管鱗癌在已確診的食管癌中占據90％的比例，而其中大約70％的病例發(fā)生在中國。食管鱗癌是世界第六、中國第四致死性

2、的癌癥，其5年總生存率不超過25％，主要歸咎于患者在確診時就已經進入晚期，往往伴隨著腫瘤局部浸潤和遠端轉移。因此，提高食管鱗癌的早期診斷和抑制腫瘤轉移成為當前工作的重中之重。
　　microRNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，能通過降解靶mRNA或者抑制翻譯的方式來調節(jié)基因表達，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近些年的研究顯示，miRNA通過各種不同途徑參與食管鱗癌的發(fā)生和進展。在本研究中，應用一個體外Transwe

3、ll模型，旨在從包含約1000個前體miRNA的慢病毒文庫中篩查出促進食管鱗癌浸潤轉移的miRNA。結果，一個由miR-99b/let-7 e/miR-125a三者組成的miRNA基因簇從候選者中脫穎而出。過表達miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇在體外促進食管鱗癌細胞的侵襲和遷移，并且誘導動物體內實驗性轉移;與此同時，對細胞增殖和細胞周期并無影響。在食管鱗癌組織標本中，檢測到miR-99b/let-7e/miR-125

4、a的高表達與淋巴結轉移成正相關。應用生物信息學分析，預測到轉錄因子ZEB1能結合在miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇的啟動子區(qū)，并通過ChIP實驗加以證實。進一步發(fā)現ZEB1在轉錄水平調節(jié)miR-99b/let-7e/miR-125a的表達，敲降ZEB1會引起miRNA成熟體和初級轉錄本的降低。為了尋找miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇在食管鱗癌中的潛在靶基因，結合基因芯片表達譜數據和公共預測軟件分析

5、，在隨后的研究中揭示出ARID3A是miR-99b/let-7 e/miR-125a基因簇的直接靶基因。在細胞系中敲降ARID3A能夠模擬過表達miR-99b/let-7e/miR-125a的細胞表型變化，而過表達ARID3A則抵消miR-99b/let-7e/miR-125a的促轉移功能。此外，ZEB1能夠下調ARID3A的表達，并且此調節(jié)是依賴于miR-99b/let-7e/miR-125a的。最后，還分析了GEO數據庫中的食管鱗癌

6、標本，發(fā)現ARID3A與ZEB1的表達成負相關關系。
　　綜上所述，miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇在食管癌轉移過程中擔當驅動因子，ZEB1在轉錄水平調節(jié)mi-99b/let-7e/miR-125a的表達。作為其下游的直接靶基因，ARID3A在腫瘤細胞運動中起阻礙作用，并且被ZEB1以依賴于miRNA的方式下調。通過分析臨床數據，發(fā)現miR-99b/let-7e/miR-125a的表達與淋巴結轉移成正相關。我們

7、的研究闡明了mi-99b/let-7e/mi-125a基因簇在食管鱗癌轉移中的重要作用。
　　第二部分 USP39促進食管鱗癌的生長并且預測不良預后
　　泛素-蛋白酶體系統是真核細胞內廣泛存在的蛋白質調節(jié)系統，參與細胞內80％以上蛋白質的降解。該系統存在一個可逆的環(huán)節(jié)，去泛素化酶(DUB)就在這個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前研究證實，存在6種不同類型的DUB，均能對底物蛋白上標記的泛素分子鏈進行水解，從而阻止蛋白被降解。而某些D

8、UB的表達失調、功能異常直接關乎代謝紊亂、精神疾病或者腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　為了鑒定與腫瘤發(fā)展相關的DUB，應用一個靶向98個已知人源DUB的siRNA文庫展開系統的篩查。先向目標細胞轉染每一個DUB siRNA，48小時后通過SRB染色、計數的方法，判別各處理組對細胞存活的影響。在對前期篩選結果進行簡單的預實驗檢測后，發(fā)現USP39的效果比較顯著，然后決定開展USP39在食管癌中功能機制的進一步研究。
　　首先，證明USP

9、39對細胞增殖有明顯的促進作用。穩(wěn)定敲降USP39的KYSE450細胞表現出強烈的細胞增殖抑制、單細胞克隆形成減少和裸鼠移植瘤生長緩慢的特征。而在USP39穩(wěn)定過表達的食管癌細胞中，則表現出相反的效果，具體體現為促進細胞增殖、增強克隆形成能力和加快裸鼠移植瘤生長。
　　緊接著，在對細胞凋亡的研究中，發(fā)現敲降USP39雖不能直接誘導細胞凋亡，但卻能大幅度增強順鉑對食管癌細胞的殺傷力。進一步的分子機制研究顯示，敲降USP39促進PAR

10、P蛋白的切割，從而加速細胞的不穩(wěn)定，為走向細胞凋亡埋下伏筆。敲降USP39還會促進Bak、抑制Bcl-2蛋白水平的表達，這些都是與細胞凋亡過程密切相關的明星分子。而在KYSE30細胞中，過表達USP39能夠幫助細胞抵御化療藥物順鉑的損傷，具體表現為抑制PARP和Caspase3的活性切割。因此，認為敲降USP39具有潛在的臨床應用價值，可能幫助食管癌患者增加對順鉑（乃至其它化療藥）治療的敏感性。
　　另外，通過體外Transwel

11、l實驗證實了USP39促進細胞遷移的能力，敲降USP39則表現出抑制遷移的效果。并且USP39對細胞遷移的影響是不依賴于細胞增殖或細胞凋亡的。
　　此外，為了研究USP39發(fā)揮功能的機制，采用免疫沉淀—質譜(IP-MS)的方法，鑒定出一系列在食管癌細胞內與USP39發(fā)生相互作用的蛋白。其中，大部分都是組成剪接體復合物或者核糖體復合物的小核糖核蛋白，例如，比較知名的有EFTUD2，PRPF3，PRPF31，PRP6等。而對IP-MS

12、的結果進行GO分析，目標富集頻率最高的生物學進程是“剪接體介導的mRNA剪接”(36.2％)，隨后依次是“RNA剪接”(27.7％)和“mRNA加工”(25.5％)。在應用KEGG分析后，只得到兩條信號通路，分別是剪接體信號通路和核糖體信號通路。結合文獻報道，推測USP39直接關乎剪接體或者核糖體的穩(wěn)定性，進而影響pre-mRNA的成熟、蛋白質的翻譯，最終調節(jié)腫瘤細胞的生長和存活。然而，還需要更多的研究數據來證明這一假設。
　　最

13、后，為了研究USP39在臨床上的重要意義，通過免疫組化的方法檢測了199例食管癌組織芯片中USP39的表達情況。結果發(fā)現，USP39高表達的食管癌患者往往預后較差，其5年總生存率在25％左右;相比之下，USP39低表達的食管癌患者總生存期和無疾病生存期均比較高，其5年總生存率超過50％。
　　綜上所述，本研究結果表明USP39對食管癌增殖起到促進作用，敲降USP39能夠抑制細胞體外增殖、減少克隆形成、減緩裸鼠移植瘤生長，還能夠增強