羥氯喹對酪氨酸激酶抑制劑耐藥慢性粒細胞白血病細胞的作用和機制研究.pdf

1、第一章羥氯喹增強酪氨酸激酶抑制劑對T315I突變細胞的殺傷作用
　　背景:
　　T315I是最常見的BCR-ABL激酶區(qū)點突變，該突變造成BCR-ABL融合蛋白第315位蘇氨酸被異亮氨酸取代，引起融合蛋白的構象和功能發(fā)生變化，是造成CML多藥耐藥的重要原因。帶有BCR-ABLT315I突變的CML對伊馬替尼、達沙替尼、尼羅替尼和博舒替尼等多種TKIs耐藥，第三代TKIs-博納替尼是目前治療T315I突變CML的一線藥物，另外

2、有文獻報道血管表皮生長因子受體抑制劑—阿西替尼也可以在體外殺傷T315I突變的CML細胞。在藥物壓力下腫瘤細胞可以通過“自噬”來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)避免細胞凋亡，因此“自噬”是腫瘤細胞對抗藥物殺傷的利器。伊馬替尼通過抑制BCR-ABL的激酶活性在殺傷CML細胞的同時也誘導了CML細胞自噬，自噬在一定程度上削弱了伊馬替尼的殺傷作用。在伊馬替尼治療的同時，利用自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)抑制CML細胞自噬可以顯著增強伊馬替尼的抗腫瘤作用。在T315

3、I突變CML細胞中，阿西替尼、博納替尼能否誘導細胞自噬，自噬是否為T315I突變CML細胞逃避藥物殺傷的一種機制，自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)能否增強阿西替尼、博納替尼對T315I突變CML細胞的殺傷作用目前尚無報道。
　　目的:
　　研究自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)是否能夠增強阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細胞的殺傷，并進一步揭示HCQ的作用機制，為T315I突變CML的治療提供思路和方向，為推動HCQ聯(lián)合TK

4、Is在耐藥CML治療中的應用奠定基礎。
　　方法:
　　以穩(wěn)定表達BCR-ABLT315I的32D細胞（32Dp210-T315I細胞）為主要研究對象，利用Western Blot檢測LC3Ⅱ的表達、利用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察自噬小體，分析阿西替尼、博納替尼是否能夠誘導細胞自噬。檢測HCQ能否抑制阿西替尼、博納替尼誘導的細胞自噬，并比較阿西替尼、博納替尼聯(lián)合/不聯(lián)合HCQ處理后32Dp210-T315I細胞的凋亡（流式檢測

5、AnnexinⅤ/7AAD）、克隆形成（在半固態(tài)的甲基纖維素培養(yǎng)液中進行7天的克隆形成實驗）、周期（細胞固定/破膜后經(jīng)PI染色，并采用流式細胞儀檢測）及細胞衰老（衰老相關β-半乳糖苷酶染色），分析HCQ是否能夠增強阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細胞的殺傷作用。為了進一步驗證HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮作用，利用shRNA敲降自噬蛋白ATG7來抑制細胞自噬，阿西替尼、博納替尼處理ATG7敲降和未敲降的32Dp210-T315

6、I細胞后比較細胞的凋亡和周期，分析抑制自噬是否增強了阿西替尼、博納替尼在T315I突變CML治療中的作用。采用32Dp210-T315I細胞建立裸鼠皮下成瘤的模型，比較阿西替尼單藥治療和HCQ聯(lián)合阿西替尼治療對小鼠腫瘤的抑制作用。
　　結果:
　　阿西替尼、博納替尼誘導32Dp210-T315I細胞自噬。HCQ抑制了阿西替尼、博納替尼誘導的細胞自噬，并且增強了阿西替尼、博納替尼誘導的32Dp210-T315I細胞凋亡，增強阿

7、西替尼、博納替尼對細胞克隆形成的抑制作用;但并不能增強阿西替尼、博納替尼誘導的32Dp210-T315I細胞周期阻滯和細胞衰老。靶向ATG7的shRNA可以有效敲降ATG7蛋白的表達，并抑制了阿西替尼、博納替尼誘導的32Dp210-T315I細胞自噬。與HCQ的作用相似，ATG7蛋白敲降增強了阿西替尼、博納替尼誘導的細胞凋亡，對阿西替尼、博納替尼誘導的細胞周期阻滯無影響。
　　結論:
　　HCQ通過抑制自噬增強了阿西替尼、博

8、納替尼對32Dp210-T315I細胞的殺傷作用。
　　第二章羥氯喹促進NKG2D-ULBP4介導的Vγ9Vδ2 T殺傷酪氨酸激酶抑制劑耐藥的CML細胞
　　背景:
　　通過靶向自噬HCQ不僅可以提高多種藥物的抗腫瘤作用，還可以有效促進腫瘤的免疫清除，抑制低氧誘導的自噬可以提高肺癌細胞對NK細胞殺傷作用的敏感性，抑制黑色素瘤細胞自噬也可以促進CTL殺傷黑色素瘤細胞，抑制自噬也可以增強IL2及某些腫瘤疫苗的治療作用。免疫

9、治療已經(jīng)成為白血病治療的趨勢，Vγ9Vδ2 T細胞是一種具有很強腫瘤殺傷能力的免疫細胞，甚至可以有效殺傷TKIs耐藥的CML細胞，是細胞免疫治療的“明日之星”。本部分旨在研究HCQ是否能夠促進Vγ9Vδ2 T細胞殺傷TKIs耐藥的CML細胞，并揭示其作用機制。
　　目的:
　　探索自噬抑制劑—羥氯喹(HCQ)是否能夠增強Vγ9Vδ2 T細胞對TKIs耐藥CML細胞的殺傷，并進一步揭示其作用機制，為推動HCQ聯(lián)合Vγ9Vδ2

10、T細胞免疫治療在TKIs耐藥CML治療中的應用奠定基礎。
　　方法:
　　以K562/GO1細胞（人CML伊馬替尼耐藥株）和K562細胞（人CML伊馬替尼敏感株）為實驗對象，通過Western Blot檢測細胞內(nèi)LC3Ⅱ、P62的表達、透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量，分析HCQ對細胞的自噬抑制作用。以HCQ預處理的K562/GO1細胞和K562細胞為實驗組靶細胞，PBS預處理的K562/GO1細胞和K562細胞為對照

11、組靶細胞;以健康志愿者外周血來源的Vγ9Vδ2T細胞為效應細胞。將CML細胞株與Vγ9Vδ2 T細胞以不同的效靶比共培養(yǎng)進行殺傷實驗，比較實驗組靶細胞和對照組靶細胞對Vγ9Vδ2 T細胞敏感性的差別。靶細胞與效應細胞以1∶1的效靶比共培養(yǎng)4h后，流式細胞儀檢測Vγ9Vδ2 T細胞的脫顆粒水平，分析不同靶細胞誘發(fā)Vγ9Vδ2 T細胞脫顆粒的差異，并利用CML患者來源的白血病細胞作為靶細胞再次驗證脫顆粒實驗的結果。采用shRNA敲降ATG7

12、蛋白抑制細胞自噬，檢測抑制自噬是否能夠增強CML細胞對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷作用的敏感性，并檢測HCQ是否能夠增強ATG7敲降的CML細胞對Vγ9Vδ2 T細胞的敏感性，分析HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮增敏作用。流式細胞儀檢測PBS或HCQ處理對CML細胞表面NKG2DL(MICA/B、ULBP1-6)表達的影響，并利用NKG2D阻斷性抗體阻斷Vγ9Vδ2 T細胞表面NKG2D與CML細胞表面NKG2DL的相互識別，分析誘導ULBP4（

13、一種NKG2DL）在CML細胞膜表達是否為HCQ增強CML細胞對Vγ9Vδ2 T細胞敏感性的機制。通過WesternBlot、熒光定量PCR、流式細胞儀檢測ULBP4的表達，共聚焦免疫熒光顯微鏡檢測ULBP4在細胞內(nèi)的分布揭示HCQ促進ULBP4表達的機制。
　　結果:
　　HCQ可以有效阻斷K562/GO1細胞和K562細胞自噬，并且增強了K562/GO1和K562細胞對Vγ9Vδ2 T殺傷作用的敏感性。但敲降ATG7蛋白

14、阻斷細胞自噬并不能模擬HCQ的增敏作用，即使在ATG7敲降的K562/GO1和K562細胞中HCQ依舊可以提高Vγ9Vδ2 T對腫瘤細胞的殺傷作用，提示HCQ的增敏作用并不依賴于抑制腫瘤細胞自噬。HCQ誘導了ULBP4在K562/GO1和K562細胞膜表達，阻斷NKG2D與NKG2DL的相互識別后HCQ的增敏作用幾乎消失，提示誘導ULBP4在CML細胞表面表達是HCQ促進Vγ9Vδ2 T殺傷CML細胞的關鍵。進一步研究發(fā)現(xiàn)HCQ并沒有提