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文檔簡介
1、第一章羥氯喹增強酪氨酸激酶抑制劑對T315I突變細胞的殺傷作用
背景:
T315I是最常見的BCR-ABL激酶區(qū)點突變,該突變造成BCR-ABL融合蛋白第315位蘇氨酸被異亮氨酸取代,引起融合蛋白的構象和功能發(fā)生變化,是造成CML多藥耐藥的重要原因。帶有BCR-ABLT315I突變的CML對伊馬替尼、達沙替尼、尼羅替尼和博舒替尼等多種TKIs耐藥,第三代TKIs-博納替尼是目前治療T315I突變CML的一線藥物,另外
2、有文獻報道血管表皮生長因子受體抑制劑—阿西替尼也可以在體外殺傷T315I突變的CML細胞。在藥物壓力下腫瘤細胞可以通過“自噬”來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)避免細胞凋亡,因此“自噬”是腫瘤細胞對抗藥物殺傷的利器。伊馬替尼通過抑制BCR-ABL的激酶活性在殺傷CML細胞的同時也誘導了CML細胞自噬,自噬在一定程度上削弱了伊馬替尼的殺傷作用。在伊馬替尼治療的同時,利用自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)抑制CML細胞自噬可以顯著增強伊馬替尼的抗腫瘤作用。在T315
3、I突變CML細胞中,阿西替尼、博納替尼能否誘導細胞自噬,自噬是否為T315I突變CML細胞逃避藥物殺傷的一種機制,自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)能否增強阿西替尼、博納替尼對T315I突變CML細胞的殺傷作用目前尚無報道。
目的:
研究自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)是否能夠增強阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細胞的殺傷,并進一步揭示HCQ的作用機制,為T315I突變CML的治療提供思路和方向,為推動HCQ聯(lián)合TK
4、Is在耐藥CML治療中的應用奠定基礎。
方法:
以穩(wěn)定表達BCR-ABLT315I的32D細胞(32Dp210-T315I細胞)為主要研究對象,利用Western Blot檢測LC3Ⅱ的表達、利用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察自噬小體,分析阿西替尼、博納替尼是否能夠誘導細胞自噬。檢測HCQ能否抑制阿西替尼、博納替尼誘導的細胞自噬,并比較阿西替尼、博納替尼聯(lián)合/不聯(lián)合HCQ處理后32Dp210-T315I細胞的凋亡(流式檢測
5、AnnexinⅤ/7AAD)、克隆形成(在半固態(tài)的甲基纖維素培養(yǎng)液中進行7天的克隆形成實驗)、周期(細胞固定/破膜后經(jīng)PI染色,并采用流式細胞儀檢測)及細胞衰老(衰老相關β-半乳糖苷酶染色),分析HCQ是否能夠增強阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細胞的殺傷作用。為了進一步驗證HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮作用,利用shRNA敲降自噬蛋白ATG7來抑制細胞自噬,阿西替尼、博納替尼處理ATG7敲降和未敲降的32Dp210-T315
6、I細胞后比較細胞的凋亡和周期,分析抑制自噬是否增強了阿西替尼、博納替尼在T315I突變CML治療中的作用。采用32Dp210-T315I細胞建立裸鼠皮下成瘤的模型,比較阿西替尼單藥治療和HCQ聯(lián)合阿西替尼治療對小鼠腫瘤的抑制作用。
結果:
阿西替尼、博納替尼誘導32Dp210-T315I細胞自噬。HCQ抑制了阿西替尼、博納替尼誘導的細胞自噬,并且增強了阿西替尼、博納替尼誘導的32Dp210-T315I細胞凋亡,增強阿
7、西替尼、博納替尼對細胞克隆形成的抑制作用;但并不能增強阿西替尼、博納替尼誘導的32Dp210-T315I細胞周期阻滯和細胞衰老。靶向ATG7的shRNA可以有效敲降ATG7蛋白的表達,并抑制了阿西替尼、博納替尼誘導的32Dp210-T315I細胞自噬。與HCQ的作用相似,ATG7蛋白敲降增強了阿西替尼、博納替尼誘導的細胞凋亡,對阿西替尼、博納替尼誘導的細胞周期阻滯無影響。
結論:
HCQ通過抑制自噬增強了阿西替尼、博
8、納替尼對32Dp210-T315I細胞的殺傷作用。
第二章羥氯喹促進NKG2D-ULBP4介導的Vγ9Vδ2 T殺傷酪氨酸激酶抑制劑耐藥的CML細胞
背景:
通過靶向自噬HCQ不僅可以提高多種藥物的抗腫瘤作用,還可以有效促進腫瘤的免疫清除,抑制低氧誘導的自噬可以提高肺癌細胞對NK細胞殺傷作用的敏感性,抑制黑色素瘤細胞自噬也可以促進CTL殺傷黑色素瘤細胞,抑制自噬也可以增強IL2及某些腫瘤疫苗的治療作用。免疫
9、治療已經(jīng)成為白血病治療的趨勢,Vγ9Vδ2 T細胞是一種具有很強腫瘤殺傷能力的免疫細胞,甚至可以有效殺傷TKIs耐藥的CML細胞,是細胞免疫治療的“明日之星”。本部分旨在研究HCQ是否能夠促進Vγ9Vδ2 T細胞殺傷TKIs耐藥的CML細胞,并揭示其作用機制。
目的:
探索自噬抑制劑—羥氯喹(HCQ)是否能夠增強Vγ9Vδ2 T細胞對TKIs耐藥CML細胞的殺傷,并進一步揭示其作用機制,為推動HCQ聯(lián)合Vγ9Vδ2
10、T細胞免疫治療在TKIs耐藥CML治療中的應用奠定基礎。
方法:
以K562/GO1細胞(人CML伊馬替尼耐藥株)和K562細胞(人CML伊馬替尼敏感株)為實驗對象,通過Western Blot檢測細胞內(nèi)LC3Ⅱ、P62的表達、透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量,分析HCQ對細胞的自噬抑制作用。以HCQ預處理的K562/GO1細胞和K562細胞為實驗組靶細胞,PBS預處理的K562/GO1細胞和K562細胞為對照
11、組靶細胞;以健康志愿者外周血來源的Vγ9Vδ2T細胞為效應細胞。將CML細胞株與Vγ9Vδ2 T細胞以不同的效靶比共培養(yǎng)進行殺傷實驗,比較實驗組靶細胞和對照組靶細胞對Vγ9Vδ2 T細胞敏感性的差別。靶細胞與效應細胞以1∶1的效靶比共培養(yǎng)4h后,流式細胞儀檢測Vγ9Vδ2 T細胞的脫顆粒水平,分析不同靶細胞誘發(fā)Vγ9Vδ2 T細胞脫顆粒的差異,并利用CML患者來源的白血病細胞作為靶細胞再次驗證脫顆粒實驗的結果。采用shRNA敲降ATG7
12、蛋白抑制細胞自噬,檢測抑制自噬是否能夠增強CML細胞對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷作用的敏感性,并檢測HCQ是否能夠增強ATG7敲降的CML細胞對Vγ9Vδ2 T細胞的敏感性,分析HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮增敏作用。流式細胞儀檢測PBS或HCQ處理對CML細胞表面NKG2DL(MICA/B、ULBP1-6)表達的影響,并利用NKG2D阻斷性抗體阻斷Vγ9Vδ2 T細胞表面NKG2D與CML細胞表面NKG2DL的相互識別,分析誘導ULBP4(
13、一種NKG2DL)在CML細胞膜表達是否為HCQ增強CML細胞對Vγ9Vδ2 T細胞敏感性的機制。通過WesternBlot、熒光定量PCR、流式細胞儀檢測ULBP4的表達,共聚焦免疫熒光顯微鏡檢測ULBP4在細胞內(nèi)的分布揭示HCQ促進ULBP4表達的機制。
結果:
HCQ可以有效阻斷K562/GO1細胞和K562細胞自噬,并且增強了K562/GO1和K562細胞對Vγ9Vδ2 T殺傷作用的敏感性。但敲降ATG7蛋白
14、阻斷細胞自噬并不能模擬HCQ的增敏作用,即使在ATG7敲降的K562/GO1和K562細胞中HCQ依舊可以提高Vγ9Vδ2 T對腫瘤細胞的殺傷作用,提示HCQ的增敏作用并不依賴于抑制腫瘤細胞自噬。HCQ誘導了ULBP4在K562/GO1和K562細胞膜表達,阻斷NKG2D與NKG2DL的相互識別后HCQ的增敏作用幾乎消失,提示誘導ULBP4在CML細胞表面表達是HCQ促進Vγ9Vδ2 T殺傷CML細胞的關鍵。進一步研究發(fā)現(xiàn)HCQ并沒有提
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