Gli2-miR-124-AURKA信號軸影響神經膠質細胞瘤生長的分子機制.pdf

1、目的:
　　本研究通過生物信息學方法整合神經膠質瘤拷貝數(shù)變化與基因表達譜數(shù)據(jù)，篩選出可能影響神經膠質瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵基因(Gli2)，并以轉錄因子Gli2對神經膠質瘤下游靶基因的調控為重點，明確受轉錄因子Gli2調控的miRNAs，深入研究異?；罨腍h信號通路促進神經膠質細胞瘤惡性增殖的分子機制，試圖發(fā)現(xiàn)新的分子靶標，為神經膠質瘤診療新靶點的選擇提供理論依據(jù)。
　　第一部分:整合分析神經膠質瘤基因表達變化
　　方法:

2、
　　1、為了發(fā)掘可能與神經膠質瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的基因，我們通過NCBIGEO數(shù)據(jù)庫檢索神經膠質瘤cGH芯片數(shù)據(jù)，通過CGH Analytics4.0軟件進行深度分析，以期篩選出神經膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中的拷貝數(shù)變化。
　　2、通過NCBI GEO數(shù)據(jù)庫檢索神經膠質瘤表達譜芯片數(shù)據(jù)集，進行差異表達基因的meta分析，通過合并effect size以及p-value的基因芯片meta分析的方法明確不同級別膠質瘤中差異顯著的基因

3、，再將meta結果與拷貝數(shù)進行交集，以期篩選可能影響神經膠質瘤進展的關鍵基因。
　　結果:
　　1、通過對神經膠質瘤eGH芯片數(shù)據(jù)進行深度分析，我們發(fā)現(xiàn)包括107個基因在內的14個染色體區(qū)域拷貝數(shù)發(fā)生改變。
　　2、通過基因芯片meta分析，我們發(fā)現(xiàn)312個在不同級別神經膠質瘤組織中差異表達的基因，將基因芯片meta分析的結合與拷貝數(shù)變化基因取交集后，我們篩選出11個關鍵基因(MYCN、JAK2、DMRT3、CDKN2

4、C、GLI2、KLF6、TXNL4A、C9ORF53、MET、BRFA、CALMK3)。
　　結論:
　　通過整合拷貝數(shù)變化數(shù)據(jù)與基因表達譜改變，我們篩選出了11個可能參與影響神經膠質瘤發(fā)生發(fā)展的基因(MYCN、JAK2、DMRT3、CDKN2C、GLI2、KLF6、TXNL4A、C9ORF53、MET、BRFA、CALMK3)。
　　第二部分:轉錄因子Gli2功能探索
　　方法:
　　1、為了明確Gli2

5、對神經膠質瘤細胞增殖的影響，我們轉染sh-Gli2-228質粒下調神經膠質瘤細胞(H4、U87)Gli2水平，通過平板克隆形成實驗檢測抑制Gli2表達對神經膠質瘤細胞增殖的影響。為了進一步探討Gli2對神經質瘤細胞活力的影響，我們在分別轉染shRNA control質粒與shRNA-Gli2-228干擾質粒后，同時給予Gli特異性抑制劑GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）處理神經膠質瘤細胞(H4、U87)48h，通過MTT

6、實驗檢測細胞的活力。
　　2、為了探討Gli2是否影響神經膠質瘤患者的生存，我們通過R2基因芯片分析平臺，分析Gli2對神經膠質瘤患者OS、PFS的影響。
　　結果:
　　1、通過平板克隆實驗，我們發(fā)現(xiàn)干擾神經膠質瘤細胞系Gli2表達后，細胞克隆形成能力顯著下降。通過MTT檢測，我們發(fā)現(xiàn)，在轉染shRNA control質粒組，GANT61可顯著抑制神經膠質瘤細胞活力，并呈一定的劑量依賴性，然而在轉染了sh-Gli2-

7、228質粒干擾后，GANT61對神經膠質瘤活力抑制的劑量依賴性受到部分影響。
　　2、通過R2平臺進行生存分析，在多個數(shù)據(jù)集中，我們發(fā)現(xiàn)，Gli2的高表達與預后不良密切相關，Gli2高表達的患者，PFS、OS時間更短。
　　結論:
　　1、Gli2影響神經膠質瘤細胞增殖。
　　2、Gli2高表達與神經膠質瘤患者預后不良密切相關。
　　第三部分:轉錄因子Gli2調控神經膠質瘤細胞miR-124表達
　　

8、方法:
　　1、為了研究Gli2是否參與調控神經膠質瘤細胞miRNA的表達，我們首先采用Gli特異性抑制劑GANT61(20μM，48h)阻斷H4細胞Hh信號通路，通過miRNA表達譜芯片檢測miRNA表達變化，并通過Real-time PCR方法對篩選出的差異表達基因進行驗證。
　　2、miRNA的表達受多種方式調控，為了探討Gli2是否在轉錄水平影響miR-124表達，我們采用RNAi技術干擾Gli2表達，通過Real-

9、time PCR檢測pri-miR-124、pre-miR-124與mature-miR-124的表達。
　　3、為了進一步研究Gli2是否影響miR-124的轉錄，我們通過生物信息學在線分析預測在miR-124的轉錄起始位點上游區(qū)域是否存在潛在的Gli2結合位點，并通過ChIP實驗檢測Gli2是否與預測位點相結合。
　　結果:
　　1、采用GANT61抑制Hh信號通路后，通過miRNA表達譜芯片檢測，我們發(fā)現(xiàn)34個m

10、iRNA的表達發(fā)生改變。通過Real-time PCR對芯片篩選出的差異表達miRNA進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)，miR-124，miR-302d，miR-519a，miR-335和miR-122表達變化情況與芯片結果一致。
　　2、采用RNAi技術干擾Gli2表達后，通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，神經膠質瘤細胞pre-miR-124，pri-miR-124，mature miR-124表達增加。
　　3、通過生物信息學在

11、線分析預測在miR-124的轉錄起始位點上游區(qū)域存在7個轉錄因子Gli2的潛在結合位點(BS1:-9789～-9798，BS2:-9255～-9234，BS3:-6235～-6244,BS4:-6034～-6025,BS5:-5547～-5538,BS6:-2944～-2935,and BS7:-560～-551)。ChIP實驗證實Gli2與miR-124的轉錄起始位點上游序列(BS2:-9255AGGCTGGTTTCAAACTCCTG

12、-9234)相結合。
　　結論:
　　1、Gli2導致神經膠質瘤細胞miRNA表達譜發(fā)生改變。
　　2、Gli2通過與miR-124轉錄起始位點上游序列結合，在轉錄水平調控miR-124表達。
　　第四部分:miR-124靶向調控神經膠質瘤細胞AURKA表達
　　方法:
　　1、我們通過生物信息學預測miR-124的下游靶基因。
　　2、為了明確miR-124是否調控AURKA表達，我們分別上調

13、/下調miR-124表達，通過Real-time PCR和western blot檢測上調/下調miR-124對神經膠質瘤細胞AURKA表達的影響。
　　3、為了進一步明確miR-124是否通過與AURKA3'-UTR結合，直接靶向調控AURKA分子，我們通過luciferase實驗檢測miR-124對AURKA3'-UTR(wt)以及AURKA3'-UTR(mut)熒光素酶報告基因活性的影響。
　　結果:
　　1、通

14、過生物信息學預測，我們發(fā)現(xiàn)，AURKA是miR-124的潛在靶基因。
　　2、過表達miR-124后，神經膠質細胞AURKA mRNA與AURKA蛋白表達下降;反之，干擾miR-124表達后，神經膠質瘤細胞AURKA mRNA與AURKA蛋白表達增加。
　　3、Luciferase檢測發(fā)現(xiàn)，miR-124通過與AURKA3'-UTR區(qū)結合，影響神經膠質瘤細胞AURKA表達。
　　結論:
　　1、miR-124負性

15、調控神經膠質瘤細胞AURKA表達。
　　2、miR-124通過與AURKA mRNA3'-UTR結合而發(fā)揮抑制AURKA表達的功能。
　　第五部分:Gli2/miR-124/AURKA信號軸影響神經膠質瘤細胞增殖
　　方法:
　　1、我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，通過GANT61阻斷Hh信號通路后，H4細胞基因表達譜發(fā)生改變，其中AURKA表達下降，然而對其啟動子區(qū)進行分析并未發(fā)現(xiàn)潛在的Gli2結合位點。我們在本項目前一部

16、分的研究已經證實Gli2調控miR-124表達，且miR-124靶向調控AURKA分子，為了探討Gli2是否通過miR-124影響AURKA表達，我們在給予GANT61阻斷Hh信號通路的同時，干擾miR-124，通過western blot和Real-time PCR分別檢測AURKA蛋白和mRNA水平。
　　2、為了進一步明確Gli2是否通過miR-124調控AURKA，我們在轉染Gli2干擾質粒的同時下調miR-124水平，通

17、過western blot和Real-time PCR分別檢測AURKA蛋白和mRNA變化。
　　結果:
　　1、通過western blot與Real-time PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)，采用GANT61抑制神經膠質瘤細胞Hh信號通路后，AURKA表達下降，而在抑制Hh信號的同時聯(lián)合干擾miR-124，AURKA表達有所增加。
　　2、通過western blot與Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與轉染空載組相比，轉