呋喃二烯抗腫瘤作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究的目的首先是觀察呋喃二烯（FDE）在體外對(duì)18種廣泛選取的、具有藥效學(xué)統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)的腫瘤細(xì)胞株生長的抑制作用，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察該藥物的抗瘤譜范圍，評(píng)價(jià)該藥物的體外藥效，并進(jìn)一步探討其對(duì)篩選出的最敏感瘤株人胃癌細(xì)胞MGC-803誘導(dǎo)凋亡的作用研究；其次是呋喃二烯對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803 nu/nu裸鼠移植瘤生長的影響，評(píng)價(jià)其體內(nèi)藥效，該成果將為FDE的藥理藥效深入研究提供基礎(chǔ)。
　　2.研究方

2、法：
　　2.1呋喃二烯抗腫瘤篩選
　　為明確呋喃二烯在體外對(duì)各類腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用，實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)，觀察不同濃度的FDE對(duì)各類腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用。受試藥物濃度設(shè)置指標(biāo)為10、20、40、80、160、320、640μg/ml等共7個(gè)，受試藥物的對(duì)象為以下腫瘤細(xì)胞株（人直腸癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1、人肺癌細(xì)胞NCI-H292、人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460、人非

3、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1650、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞HepG-2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、人惡性黑色素瘤細(xì)胞A-375、人胃癌細(xì)胞HGC-27、人胃癌細(xì)胞MGC-803、人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60、人慢性髓原白血病細(xì)胞K-562、人急性非B非T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Reh和人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1），以5-氟尿嘧啶為陽性對(duì)照藥，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值，采用G

4、raphpad Prism5.0的統(tǒng)計(jì)作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理分析、藥物作用腫瘤細(xì)胞株生長趨勢(shì)曲線的繪制，以此計(jì)算出半效濃度（IC50，μg/ml）和各個(gè)有效作用濃度下的細(xì)胞增殖抑制率（Inhibition rate）。同時(shí)制備大鼠正常骨髓細(xì)胞，考察FDE對(duì)大鼠正常骨髓細(xì)胞的影響。篩選出對(duì)FDE最敏感細(xì)胞株，并對(duì)其展開進(jìn)一步的凋亡機(jī)制的研究。
　　2.2呋喃二烯誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡機(jī)制研究
　　通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)篩選，選

5、出FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用最佳。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用方法包括：
　?、俨捎肕TT法檢測(cè)不同濃度不同藥物作用時(shí)間對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制增殖的影響；
　?、诘怪蔑@微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，Hoechst33242染色法結(jié)合結(jié)合熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化；
　　③Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；
　?、蹹CFH-DA熒光探針結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性氧

6、水平；
　?、萘_丹明123染色法合用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化；
　　⑥PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響；
　　⑦Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性試劑盒結(jié)合分光光度計(jì)檢測(cè)OD值的方法，通過OD值變化檢測(cè)受試細(xì)胞裂解液中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的變化。
　　2.3呋喃二烯體內(nèi)抑制MGC-803細(xì)胞生長效應(yīng)的評(píng)價(jià)
　　

7、根據(jù)體外篩選結(jié)果篩選出對(duì)喃二烯最敏感的MGC-803細(xì)胞株進(jìn)行體外擴(kuò)增，制備成細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，取此單細(xì)胞懸液的0.2ml，接種于多只4-6周齡BALB/c-nu/nu雄性裸鼠右前肢腋部的皮下，由此建立裸鼠移植瘤模型并開始檢疫觀察。建立模型成功后，選取40只移植瘤生長狀態(tài)較好的裸鼠，測(cè)量腫瘤體積稱量體重，隨即建立空白對(duì)照組、FDE是藥物實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組并開始給藥。各組均采取尾靜脈注射的給藥方式，隔日采用電子天平

8、稱量裸鼠體重、游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長短徑，同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察期，觀察FDE對(duì)該敏感細(xì)胞株MGC-803裸鼠移植瘤生長的抑制作用，直至給藥結(jié)束。給藥結(jié)束后測(cè)量移植瘤體積，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，剝離取出瘤塊稱重并拍照。依據(jù)腫瘤的相對(duì)體積、瘤重的變化評(píng)價(jià)藥物的療效，依據(jù)裸鼠的體重變化評(píng)價(jià)藥物的安全性，應(yīng)用Graphpad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3.研究結(jié)果：
　　3.1呋喃二烯抗腫瘤篩選結(jié)果
　　

9、FDE對(duì)受試細(xì)胞的體外增殖抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受試藥物設(shè)置濃度基本涵蓋了藥物效應(yīng)窗口，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果基本一致。FDE對(duì)肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、人黑色素瘤和個(gè)別白血病細(xì)胞均呈現(xiàn)較好的生長抑制作用，藥物與腫瘤細(xì)胞作用48小時(shí)，半效濃度（IC50）在16.58~55.30μg/ml，P<0.05。其中對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803作用最強(qiáng)，IC50為16.58μg/ml。但FDE對(duì)白血病細(xì)胞Reh、THP-1和卵巢癌細(xì)胞SKOV-3不敏

10、感，抑制作用（IC50）分別為187.19μg/ml、239.5μg/ml、206μg/ml。FDE在40μg/ml濃度以下，對(duì)正常大鼠骨髓細(xì)胞無抑制作用。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶25ug/ml的固定作用濃度，同時(shí)對(duì)受試細(xì)胞株作用48h后顯示其細(xì)胞增殖抑制率，范圍為11.29％~91.46%。
　　3.2呋喃二烯誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的機(jī)制初探
　　①M(fèi)TT結(jié)果顯示，F(xiàn)DE可明顯抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的

11、增值并誘導(dǎo)其凋亡。隨著FDE濃度增加和作用時(shí)間的延長，對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，具有時(shí)間和劑量依賴性。
　?、谄胀ü鈱W(xué)顯微鏡下觀察，隨著FDE濃度的增加，MGC-803細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞碎裂、染色質(zhì)濃縮，同時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。Hoechst33242染色結(jié)果顯示，隨著藥物劑量的增大，藍(lán)色熒光明顯加深且數(shù)量增多，可以看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染。
　?、弁ㄟ^Annexin V-FITC/PI雙染后利用流式

12、細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組中正常細(xì)胞占較大百分比，而80μg/ml FDE組中正常細(xì)胞變少，凋亡細(xì)胞數(shù)變多，平均凋亡率為24.17±4.24%，并且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　?、蹹CFH-DA結(jié)果顯示，隨著FDE濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，當(dāng)藥物濃度為80μg/ml時(shí)，活性氧水平是未加藥組的1.35倍。
　?、萁?jīng)羅丹明123染色法檢測(cè)線粒體跨膜電位變化，結(jié)果表明在FDE藥物組作用48h后，人胃癌細(xì)胞

13、MGC-803線粒體中的羅丹明123的蓄積量開始呈現(xiàn)出不同程度的下降，下降趨勢(shì)隨藥物組劑量的增大而越發(fā)顯著(P<0.01)。
　?、轕I實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藥物實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞明顯增多，G2/M期和S期細(xì)胞均減少，人胃癌細(xì)胞MGC-803在FDE的作用下明顯改變了周期的分布，與對(duì)照組相比G1期的細(xì)胞百分比增高明顯，S和G2期細(xì)胞顯著降低，將細(xì)胞阻滯在G1期。
　?、逤aspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性

14、檢測(cè)結(jié)果顯示FDE明顯提高了Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性，當(dāng)終濃度分別為20、40、80μg/ml FDE作用之后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性比對(duì)照組分別增高了（1.06、0.82、1.38）倍、（1.24、0.83、1.51）倍、（1.39、1.31、1.98）倍，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.3呋喃二烯體內(nèi)抑制MGC-803細(xì)胞生長

15、藥效學(xué)評(píng)價(jià)
　　FDE對(duì)受試動(dòng)物的體內(nèi)生長抑瘤效應(yīng)的評(píng)價(jià)顯示，高、中和低劑量組對(duì)MGC-803裸鼠移植瘤的抑瘤率分別為：33.00%(P<0.05)、27.99%和23.88%。通過觀察腫瘤的生長曲線，可以看出與對(duì)照組相比，荷瘤裸鼠腫瘤的生長速度在給藥后有減慢的現(xiàn)象，且隨著FDE藥物劑量的增大而變緩，腫瘤體積逐漸變小，但其抑瘤率不明顯。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的裸鼠生長情況穩(wěn)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均未出現(xiàn)死亡個(gè)體。陽性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶組裸鼠均呈現(xiàn)出

16、體重相對(duì)減輕的情況，F(xiàn)DE實(shí)驗(yàn)組的裸鼠體重則表現(xiàn)為增加，與空白對(duì)照組相比未出現(xiàn)明顯變化。
　　4.研究結(jié)論
　　4.1通過18種瘤細(xì)胞的抗腫瘤篩選，呋喃二烯在體外均表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤作用，且具有良好的濃度依賴性。該結(jié)果為其在體外抑制瘤細(xì)胞作用機(jī)制的研究提供前提。
　　4.2呋喃二烯能抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，且具有濃度與時(shí)間依賴性。人胃癌MGC-803細(xì)胞的凋亡機(jī)制可能為線粒體途徑啟動(dòng)、細(xì)胞周期發(fā)生