miR-294調(diào)控TGF-β1通路抑制老年腎間質(zhì)纖維化機制研究.pdf

1、目的：
　　腎臟衰老是老年慢性腎臟病的病理學基礎，而腎間質(zhì)纖維化是腎臟衰老的重要表現(xiàn)。腎間質(zhì)纖維化，以細胞外基質(zhì)沉積為特征，導致腎臟結(jié)構和功能的喪失。防治腎間質(zhì)纖維化是保護老年腎功能、阻止CKD進展的重要手段。前期研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞外泌的微囊泡(MSC-MV)中miR-294表達下調(diào)，并且miR-294抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導的人腎小管上皮細胞（HK-2）細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)。本研究將進一步

2、解析miR-294調(diào)控TGF-β1通路的靶基因，探討miR-294對老年腎間質(zhì)纖維化的治療作用。
　　方法：
　　(1)過表達HK-2中miR-294，并建立TGF-β1誘導HK-2上皮轉(zhuǎn)分化模型，運用蛋白印記法(Western Blot)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫熒光方法檢測EMT相關指標，驗證miR-294干預腎小管生皮細胞EMT的作用。利用生物信息學方法查找miR-294在TGF-β1通路的可能靶基因，

3、并運用雙熒光素酶實驗進行驗證。
　　(2)建立老年小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎臟損傷模型，利用轉(zhuǎn)柒試劑尾靜脈注射miR-294，通過檢測腎臟組織病理、腎間質(zhì)纖維化標志物差異評估m(xù)iR-294干預老年腎間質(zhì)纖維化的療效。
　　結(jié)果：
　　(1)體外實驗：①TGF-β1（10ng/ul）誘導HK-2細胞纖維化48小時后，miR-294mimic/NC-miR(20pm/ul)轉(zhuǎn)染HK-2細胞24小時，可見miR-29

4、4+TGF-β1組細胞內(nèi)miR-294明顯過表達（增高248454倍）。②經(jīng)TGF-β1誘導的HK-2細胞，失去上皮細胞形態(tài)，呈現(xiàn)為長梭形的成纖維細胞形態(tài);轉(zhuǎn)染NC-miR后，細胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染之前無明顯改變;轉(zhuǎn)染miR-294mimic后，部分細胞可恢復正常形態(tài)。③Western Blot顯示轉(zhuǎn)染miR-294后間質(zhì)細胞的標志物α-SMA、fibronectin、COL3A1表達量較TGF-β1組明顯下調(diào)，上皮細胞標記物E-cadheri

5、n較TGF-β1組有所增加;免疫熒光顯示TGF-β1組EMT標志物α-SMA表達量較空白組明顯上升，轉(zhuǎn)染miR-294后纖維化α-SMA表達量明顯下調(diào)。④利用生物信息學分析miR-294的可能靶基因為RBL1;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示共轉(zhuǎn)染miR-294mimic后,pGL3-WT-RBL1的熒光素酶活性明顯下降(P＜0.05)，但對pGL3-Mut-RBL1的熒光素酶活性影響不明顯;共轉(zhuǎn)染后對NC組pGL3-WT-RBL1的熒光素酶

6、活性無影響;Western Blot顯示TGF-β1誘導EMT后細胞內(nèi)RBL1表達明顯增高。
　　(2)體內(nèi)試驗：①成功構建UUO老年小鼠腎損傷模型。②RT-PCR顯示與sham組及同一時間點的UUO組相比較，注入miR-294過表達轉(zhuǎn)染復合物后7天、14天小鼠腎組織miR-294的表達量明顯增高。③與同一時間點的UUO組比較,miR-294組靶基因RBL1的蛋白表達量明顯下調(diào);α-SMA、fibronectin的表達量明顯下降;