鈣拮抗劑通過調(diào)控MIF的表達拮抗大鼠心肌缺血-再灌注損傷和H9c2心肌細胞缺氧-復氧損傷的研究.pdf

1、心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）損傷，是指心肌組織缺血后血流重新恢復，組織的損傷程度較缺血時進一步加重、器官功能進一步惡化的現(xiàn)象。鈣拮抗劑通過阻斷鈣離子通道，抑制細胞外 Ca2+內(nèi)流，拮抗鈣超載從而保護心肌損傷。研究表明，鈣拮抗劑除了阻斷L-型電壓依賴性鈣離子通道（L-type voltage dependent calcium channel， L-VDCC）發(fā)揮抗心肌I/R損傷的效應之外，其心肌保

2、護效應還可能存在非L-VDCC依賴機制。本課題組前期研究表明，臨床常用鈣拮抗劑維拉帕米(verapamil，Ver)、硝苯地平(nifedipine，Nif)與碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide，F(xiàn)2，我實驗室合成的新型結構鈣拮抗劑，圖1)在心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型上，可通過非L-VDCC途徑拮抗心肌細胞H/R損傷。
　　目的：

3、>　　探討鈣拮抗劑不影響鈣通道阻斷所致血液動力學變化的劑量，對心肌 I/R損傷和 MIF表達的影響。在此基礎上，進一步在無鈣液培養(yǎng)的H9c2心肌細胞上觀察鈣拮抗劑對H/R損傷的影響，確認鈣拮抗劑的非L-VDCC依賴機制。
　　方法：
　?、艑⑿坌許D大鼠隨機分組如下進行 MIF時效關系實驗：假手術組（Sham）；缺血5 min組（I5min）；缺血15 min組（I15min）；缺血30 min組（I30min）；缺血45

4、min組（I45min）；缺血60 min組（I60min）；缺血45 min再灌注0.5h組（I45min/R0.5h）；缺血45 min再灌注1h組（I45min/R1h）；缺血45 min再灌注2h組（I45min/R2h）；缺血45 min再灌注3h組（I45min/R3h）；缺血45 min再灌注4h組（I45min/R4h）；缺血45 min再灌注6h組（I45min/R6h）。⑵將雄性SD大鼠隨機分組如下進行藥效關系實驗：

5、假手術組（Sham）；模型組（I45min/R3h）；溶劑組（DMSO）；模型+鈣拮抗劑組（F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）、Nif（0.2 mg/kg）和Dil（0.5 mg/kg））。⑶Western-blot檢測心肌組織Cleaved caspase-3的表達。⑷TUNEL檢測心肌組織細胞晚期凋亡。⑸ELISA檢測心肌組織炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。⑹Western-blot和免疫組織

6、化學法檢測心肌組織MIF蛋白的表達。⑺ELISA檢測血清MIF的含量。⑻將H9c2心肌細胞隨機分組如下進行Cleaved caspase-3時效實驗：正常組（Ctrl）；缺氧0.5h組（H0.5h）；缺氧1h組（H1h）；缺氧2h組（H2h）；缺氧3h組（H3h）；缺氧1h復氧0.5h組（H1h/R0.5h）；缺氧1h復氧1h組（H1h/R1h）；缺氧1h復氧2h組（H1h/R2h）；缺氧1h復氧3h組（H1h/R3h）；缺氧1h復氧4

7、h組（H1h/R4h）。⑼將H9c2心肌細胞隨機分組如下進行藥效實驗：正常組（Ctrl）；無鈣組（0Ca2+2h）；無鈣+鈣拮抗劑組（0Ca2+2h+鈣拮抗劑）；模型組（H1h/R1h）；溶劑組（DMSO）；模型+鈣拮抗劑組（鈣拮抗劑）。⑽Western-blot檢測Cleaved casepase-3的表達。⑾Annexin V-FITC/PI檢測細胞早晚期凋亡。⑿TUNEL檢測細胞晚期凋亡。⒀ELISA檢測細胞上清液炎癥因子IL-6

8、和IL-1β的含量。
　　結果：
　?、倥cSham組相比，大鼠心肌缺血45 min再灌注3 h（I45min/R3h）引起心肌Cleaved caspase-3表達增加、凋亡細胞增加、炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量增加。②與I45min/R3h組相比，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R心肌 Cleaved caspase-3表達，減輕細胞凋亡。③與I45min/R3h組相比，F(xiàn)2（1.5 mg/kg

9、）能減少大鼠心肌I/R炎癥因子TNF-α表達， F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R IL-6的表達，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R IL-1β的表達。④與Sham組相比，大鼠心肌I45min/R3h引起心肌組織MIF蛋白和mRNA表達減少，血清MIF含量增加。與I45min/R3h組相比，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）、

10、Ver（0.75 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能上調(diào)大鼠心肌I/R MIF蛋白表達，F(xiàn)2（1.5 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能減少大鼠心肌I/R血清MIF的含量。⑤與Ctrl組相比，H9c2心肌細胞在無鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h引起Cleaved caspase-3的表達增加，但是鈣拮抗劑不能減少Cleaved caspase-3的表達。與Ctrl組相比，無鈣液培養(yǎng)H9c2心肌細胞缺氧1h/復氧1h（H1h/R1

11、h）Cleaved caspase-3增加，Annexin V-FITC/PI檢測的早晚期凋亡細胞率增加，TUNEL檢測的晚期凋亡細胞率增加，ELISA檢測的細胞上清液中IL-6和IL-1β的含量增加。⑥與H1h/R1h組相比，Ver、Nif和F2能顯著減少無鈣液培養(yǎng)H9c2心肌細胞H/R Cleaved caspase-3的表達，Ver、Nif和F2能劑量依賴地減少無鈣液培養(yǎng) H9c2心肌細胞H/R早晚期凋亡細胞率。⑦與H1h/R1h