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文檔簡介
1、肝細胞核因子1α(HNF1α)作為肝臟中最重要的轉錄因子之一,以復合體形式參與調控多種肝臟特異基因的表達,并涉及蛋白質合成、物質代謝、損傷修復等多個生物學過程。同時HNF1α也是維持胰腺功能的重要分子,調控胰島素、葡萄糖轉運蛋白等分子的表達。在腸和腎中,HNF1α也發(fā)揮著調控發(fā)育和物質吸收的重要作用。在糖代謝中,HNF1α更是扮演著“中心分子”的作用。HNF1α的突變會引發(fā)Ⅲ型青少年發(fā)病的成人糖尿病,也就是臨床上所說的MODY3,這是一
2、種由單基因突變所導致的負顯性突變疾病,臨床上表現(xiàn)為25歲前發(fā)病,胰島素分泌不足,血糖嚴重升高等癥狀,由于患者HNF1α基因突變的晚期糖尿病并發(fā)癥的頻率高,早期診斷與適當的治療可以減少或延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。因此研究HNF1α調控機制和功能有著重要的意義。
在研究中我們通過IP-MS發(fā)現(xiàn),HNF1α是一個磷酸化蛋白質。并且我們還發(fā)現(xiàn)了一個新的磷酸化位點,Ser249位。接下來我們通過體外磷酸化實驗發(fā)現(xiàn),無論內源或者外源ATM蛋
3、白激酶都可以磷酸化HNF1α的Ser249位點。當輻射處理引發(fā)DNA損傷活化ATM激酶活性時,HNF1α的磷酸化水平顯著提高。我們發(fā)現(xiàn)使用ATM特異抑制劑KU55933處理細胞后,HNF1α磷酸化水平下降。IP-MS檢測結果也顯示抑制劑處理組249位磷酸化消失。為了進一步研究Ser249位點突變對HNF1α功能和調控機制的影響,我們構建了HNF1α-S249A突變體,通過熒光素酶報告基因實驗和real-time PCR實驗結果發(fā)現(xiàn),與野
4、生型相比,HNF1α-S249A突變體轉錄活性和下游靶基因表達均顯著下調。實驗中我們還發(fā)現(xiàn),HNF1αSer249位點的磷酸化與之前已報道的Ser247位點的磷酸化相互獨立互不影響,競爭抑制實驗顯示,HNF1α-S249A突變體不具有負顯性抑制功能。我們通過EMSA和CHIP實驗分別從體內和體外兩條途徑證明,與野生型HNF1α相比,HNF1α-S249A突變體的DNA結合能力顯著下調,間接熒光免疫實驗證明,HNF1αSer249位點突變
5、不影響HNF1α的亞細胞定位。同時我們也在體內實驗中發(fā)現(xiàn),HNF1α-S249A突變體會引起糖代謝功能異常,提示了ATM調控糖代謝過程中新的機制發(fā)現(xiàn)。我們不僅從分子水平探索了HNF1α磷酸化修飾的分子機制和生物學意義,而且通過HNF1α-WT和HNF1α-S249A轉基因小鼠實驗來研究HNF1α對于生理功能的意義。我們以轉基因野生型HNF1α作為對照研究發(fā)現(xiàn),HNF1α-S249A轉基因小鼠并未表現(xiàn)出明顯的糖尿病或者其他糖代謝異常表型,
6、體重變化、葡萄糖耐受、胰島素耐受都未出現(xiàn)異常,而丙酮酸耐受下降,說明,HNF1αSer249位點突變降低了HNF1α-S249A轉基因小鼠糖異生能力,此外,我們還對轉基因小鼠血清腫瘤標志物進行檢測,轉基因HNF1α-WT小鼠在胰腺腫瘤標志物CA242、肝癌腫瘤標志物AFP、乳腺癌腫瘤標志物CA153顯著下調,這些數據也許提示了HNF1α在腫瘤發(fā)生中的一些作用。
除了磷酸化修飾之外,我們還通過IP-MS鑒定到了HNF1α的乙?;?/p>
7、位點Lys117位。且臨床上有報道在MODY3患者中檢測到117位突變,我們推測該位點的乙?;揎棇NF1α的功能十分重要。首先我們通過Lys乙?;贵w免疫印跡發(fā)現(xiàn),HNF1α是一個乙?;鞍?,共轉染乙?;竝300和使用去乙酰酶抑制劑TSA/Nam可以促進HNF1α乙酰化,而饑餓和乙酰化酶p300抑制劑處理會降低HNF1α乙?;健M瑫r,為了進一步研究HNF1αLys117位點乙酰化對HNF1α的功能和調控機制影響,我們構建了Ly
8、s117位的點突變,通過熒光素酶報告基因實驗和real-time PCR實驗顯示,Lys117位點突變下調了HNF1α的轉錄活性。競爭抑制實驗顯示,HNF1α-Lys117位點突變體不具有負顯性抑制功能。接下來,我們通過EMSA和CHIP實驗分別從體內和體外兩條途徑證明,與野生型HNF1α相比,HNF1αLys117位突變體的DNA結合能力顯著下調,間接熒光免疫實驗證明,HNF1αLys117位點突變不影響HNF1α的亞細胞定位。同時我
9、們也在體內實驗中發(fā)現(xiàn),HNF1αLys117位點突變會引起糖代謝功能異常。我們通過免疫共沉淀相互作用和熒光共振(FRET)實驗以及生物信息學分子模建發(fā)現(xiàn),HNF1αLys117位點突變或者p300抑制劑處理會減弱其二聚體穩(wěn)定性,從而降低了HNF1α的DNA結合能力,下調了HNF1α的轉錄活性和下游靶基因表達。
縱觀整個研究過程,我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)了HNF1α的一個新的磷酸化位點和調控它的上游激酶ATM,為ATM激酶參與調控糖
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