牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6基因和TAK1基因的克隆及免疫應答研究.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）為冷溫性底棲魚類，是我國重要的經濟魚類。近年來，隨著高密度集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，魚類疾病的傳染也日益嚴重，養(yǎng)殖場中魚類大規(guī)模的死亡及其造成的重大經濟損失給人工養(yǎng)殖提出了嚴峻挑戰(zhàn)。因此，深入研究牙鲆的抗病免疫機制，探尋增強養(yǎng)殖品種免疫力的途徑和方法，培育牙鲆抗病新品系，對于牙鲆養(yǎng)殖規(guī)模的擴大十分重要。
　　Toll樣受體(TLRs)可識別病原相關分子模式(PAMPs)，是模式識別受

2、體（PRRs）家族中的成員，在先天性免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。TLRs識別并結合相應的配體后，可激活細胞內的信號轉導途徑，誘導促炎細胞因子的分泌和共刺激分子的表達，啟動特異性免疫應答反應。TRAF6和TAK1是Toll樣受體信號通路中兩個重要的接頭蛋白，可激活下游信號通路，啟動固有免疫應答反應和特異性免疫應答反應。本研究克隆到了TRAF6基因和TAK1基因的cDNA全長，并對其蛋白序列、調控區(qū)域及表達模式進行了初步分析，為進一步研究這

3、兩個基因在免疫反應中的作用機理提供了理論依據(jù)。
　　牙鲆TRAF6基因cDNA全長1953 bp，包括1713 bp的開放閱讀框（ORF），159 bp的5'UTR和81 bp的3'UTR，預測該基因編碼570個氨基酸。利用在線軟件分析了牙鲆TRAF6基因的蛋白結構域，包括N端的RING結構域，兩個鋅指結構域，一個環(huán)-環(huán)(coiled-coil)α螺旋結構域以及高度保守的MATH結構域。牙鲆TRAF6與巨石斑魚TRAF6的一致性高

4、達91％。系統(tǒng)進化樹分析表明，牙鲆TRAF6和半滑舌鰨TRAF6聚為一支，親緣關系最近。對其調控區(qū)進行初步的生物信息學分析，預測存在豐富的轉錄因子結合位點，多為參與調控炎癥反應的轉錄因子，預示了他們在免疫應答反應中的潛在功能。熒光定量PCR結果顯示牙鲆TRAF6基因廣泛的表達于各組織中，但其表達量存在顯著的差異，在腸和心臟中有較高的表達。TRAF6在腸等免疫器官中的高表達，與其在Toll樣受體信號通路中的重要作用是一致的。對牙鲆早期胚胎

5、發(fā)育不同時期TRAF6基因的表達情況進行檢測。結果顯示，TRAF6基因在所有時期都有表達，包括未受精卵，提示了TRAF6基因的母源性表達。免疫分子母源性mRNA的存在可能參與發(fā)育過程，也可能參與構建免疫體系，以保護胚胎或仔魚免受病原體的侵襲。免疫刺激實驗表明，LPS、poly I∶C和CpG ODN都可以上調TRAF6基因的表達。
　　牙鲆TAK1基因cDNA全長2086 bp，其中包括ORF1728 bp，5'UTR232 bp

6、，3'UTR128 bp，根據(jù)其完整的ORF預測TAK1基因編碼575個氨基酸殘基的蛋白。牙鲆TAK1基因與其他物種的一致性很高，與點帶石斑魚的一致性高達97％。牙鲆TAK1蛋白包括一個蛋白激酶ATP結合結構域，一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活結構域以及羧基端的環(huán)-環(huán)(coiled-coil)α螺旋結構域。對其調控區(qū)進行初步的生物信息學分析，預測存在豐富的轉錄因子結合位點，多為參與調控炎癥反應的轉錄因子，預示了他們在免疫應答反應中的潛在功

7、能。熒光定量PCR結果顯示牙鲆TAK1基因在所檢測的所有組織中都有表達，但其表達量存在明顯的差異，在腸和心臟中有較高的表達。對牙鲆早期胚胎發(fā)育不同時期TAK1基因的表達情況進行檢測。結果顯示，TAK1基因在所有時期都有表達，包括未受精卵，提示了TAK1基因的母源性表達。免疫分子母源性mRNA的存在可能參與發(fā)育過程，也可能參與構建免疫體系，以保護胚胎或仔魚免受病原體的侵襲。免疫刺激實驗表明，LPS、poly I∶C和CpG ODN都可以上