基于DNA循環(huán)放大技術的表面增強拉曼散射傳感分析方法研究及在腫瘤標志物檢測中的應用.pdf

1、本文采用了表面增強拉曼散射分析方法，制備了具有SERS活性的納米金生物條碼探針，構建了基于DNA分子機器和滾環(huán)復制的循環(huán)放大方法、DNA酶識別元件引發(fā)的靶替代循環(huán)放大方法、基于引物自產(chǎn)生的雙功能DNA適體循環(huán)放大方法和發(fā)卡DNA適體引發(fā)的循環(huán)放大方法，實現(xiàn)了基因、腫瘤細胞、生物活性小分子和蛋白質(zhì)等腫瘤標志物高靈敏度、高選擇性檢測。主要內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　1.構建了一種新型的多重循環(huán)的DNA分子機器，并首次將表面增強拉曼光譜

2、技術引入DNA分子機器循環(huán)中。利用納米金作為增強底物，制備了攜帶有大量拉曼分子的納米金生物條碼作為拉曼信號探針。以內(nèi)切酶為介導，目標DNA引發(fā)了雙重DNA循環(huán)放大反應和滾環(huán)復制放大反應(RCA)，使信號顯著增強，并通過磁性分離和洗滌，除去過量的納米金生物條碼，降低了檢測體系的背景值，從而實現(xiàn)了目標DNA的高靈敏度檢測。基于適體DNA對配體的高特異性識別和結合能力，進一步通過檢測癌細胞考察和驗證了該方法的通用性。實現(xiàn)了腫瘤細胞的高靈敏度檢

3、測，該方法檢測DNA和淋巴瘤Ramos細胞的檢測限分別可達2.0×10-16 M和8個細胞，且成功應用于復雜樣品中腫瘤細胞的選擇性分析。本方法具有通用性，只需改變DNA適體的序列，即可檢測不同的腫瘤細胞或其他腫瘤標志物。因此，該方法在腫瘤早期診斷以及基因檢測領域具有廣闊的應用前景。
　　2.研制了一個新穎的DNA酶-SERS信號放大系統(tǒng)用于L-組氨酸的檢測。DNA酶替代了傳統(tǒng)DNA循環(huán)放大方法中的DNA適體識別目標分子。利用DNA

4、酶和目標分子結合后獨特的共反應催化剪切活性，首次構建了基于DNA酶識別和引發(fā)的雙重循環(huán)放大模式。在靶替代循環(huán)反應中，利用靶的再循環(huán)利用，實現(xiàn)了高效的源頭信號放大。另外在發(fā)卡DNA循環(huán)反應的過程中，固定在磁性微球上的發(fā)卡探針被不斷打開，進而與大量的SERS標記物生物條碼結合大量的發(fā)卡，大大提高了L-組氨酸的檢測靈敏度。在最佳反應條件下，檢測限達0.56 nM(3σ)，可用于實際樣品細胞勻漿中的L-組氨酸的測定。該方法設計簡單，操作方便，靈

5、敏度高且具有良好的選擇性。
　　3.利用適體的結構互變性質(zhì)，制備了新穎的雙功能適體配合物，構建了一種基于PS-SDP反應平行測定ATP和溶菌酶的雙功能SERS檢測方法。該方法以雙功能適體和引發(fā)鏈的互補形成的配合物作為媒介，通過靶結合后引發(fā)的PS-SDP反應和DNA多重循環(huán)放大反應，實現(xiàn)了ATP和溶菌酶的平行靈敏檢測。ATP和溶菌酶的檢測限分別達0.05 nM和10fM。此方法具有靈敏度高、選擇性好、檢測方法簡便快捷等優(yōu)點，可用于人

6、體血清樣品的ATP和溶菌酶測定。本工作具有廣泛適用性，只需改變DNA適體的序列，即可實現(xiàn)基因、蛋白質(zhì)以及細胞等腫瘤標志物的高靈敏度和高選擇性雙功能平行檢測，為雙功能生物傳感分析方法供了新的思路和途徑。
　　4.基于發(fā)卡型適體DNA特異性識別目標物和結構互變特性，采用SERS檢測技術，首次設計了發(fā)卡型適體DNA循環(huán)SERS信號放大傳感分析方法，用于溶菌酶的檢測。本方法的原料僅為發(fā)卡型適體DNA、聚合酶、內(nèi)切酶和SERS探針。設計了靶

7、替代循環(huán)和發(fā)卡DNA聚合酶鏈剪切循環(huán)模式，相比于較前期DNA酶-SERS信號放大系統(tǒng)，其放大效率顯著提高。在最佳反應條件下，采用溶菌酶為模型，測得溶菌酶濃度的線性范圍為5.0×10-15～5.0×10-12 M，檢測限為2fM(3σ)，比前期雙功能循環(huán)放大SERS分析方法檢測溶菌酶提高了一個數(shù)量級，并且通過選擇性實驗的考察驗證了該方法的良好的選擇性。該方法易于合成，操作簡單，靈敏度高，選擇性好，在蛋白質(zhì)及其它腫瘤標志物的檢測領域具有廣闊