載體構建

1、載體構建分為以下步驟：1.載體的選擇和引物設計以擴增目標基因2.目標片段的PCR擴增3.載體和目標片段的限制性酶切4.連接轉化5.挑取克隆提質粒6.單克隆的驗證及送樣測序。載體的選擇載體的選擇實驗室常用的載體有pUC19（擴繁目標片段），pet28a（原核表達載體Kna），pGEX4T1(原核表達載體Amp)，pCINEO(真核表達載體Amp)，pCDNA3.1(真核表達載體Amp)，pLKO.1(shRNA構建Amp)。根據(jù)所要構建的

2、質粒目的的差異以及載體和目標片段的酶切位點分析結果來選擇載體。舉例如下：實驗目的是將MYC基因插入到載體中，轉染進細胞中表達。應選用真核表達載體pCINEO或pCDNA3.1。引物設計引物設計引物設計的目的是將目標片段擴增出來以便與載體連接，所以在引物的兩端應人為加上酶切位點，酶切位點前加上保護堿基。在選擇酶切位點是應注意，選擇的應該是目的基因片段中沒有而載體上有的限制性內切酶，防止目標片段被切不完整，也便于和載體連接。載體構建之后我們

3、的目的是要表達，所以應該加入標簽以便westernblot檢測蛋白是否表達。常用的標簽有Flag標簽、6XHis標簽、HA標簽和Myc標簽。Flag標簽：DYKDDDDKGATTACAAGGATGACGACGATAAG6XHis標簽：HHHHHHCACCACCACCACCACCACHA標簽：YPYDVPDYATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTMyc標簽：EQKLISEEDL這些標簽被表達成氨基酸后，特定的氨基酸序列會