低氧對新生小鼠心臟成纖維細胞增殖與表型的影響及其表型轉化機制的實驗研究.pdf

1、目的：探討低氧對新生小鼠心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖與表型的影響及其表型轉化的相關機制。
　　方法：體外分離培養(yǎng)新生小鼠CFs，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，同時運用免疫熒光染色和流式細胞技術檢測CFs特異性的標記物盤狀結構域受體2(DiscoidinDomain Receptor2，DDR2)。分別應用Real-time RCR和Western Blot方法檢測低氧誘導因子-1α(hypoxi

2、a inducible factor-1α，HIF-1α)的表達。RT-CES系統(tǒng)監(jiān)視CFs的生長狀況；CCK-8法檢測CFs的增殖情況。分別通過Real-time RCR、免疫熒光染色、流式細胞技術和Western Blot技術從核酸和蛋白水平檢測CFs向心臟肌成纖維細胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)表型轉化的標記物α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。運用Weste

3、rn Blot技術檢測JNK的磷酸化水平。
　　結果：1.CFs的純度鑒定：分離培養(yǎng)的細胞呈梭形或多角形，胞體及細胞核較大，細胞核呈橢圓形，無自發(fā)性搏動，呈現(xiàn)出CFs的典型形態(tài)特征。Vimentin和DDR2的免疫熒光染色呈陽性。流式細胞技術檢測結果顯示，Vimentin和DDR2的陽性率分別為99.94％、94.76%。
　　2.低氧對CFs增殖的影響：常氧組、1%O2組和5%O2組中，CFs持續(xù)地表達HIF-1α mRN

4、A，它們之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與常氧組相比，1%O2組和5%O2組CFs中HIF-1α蛋白的表達顯著性增加(P<0.05)。與常氧組相比，在140h時期內，1%O2組CFs的細胞指數(shù)值顯著性下降；5%O2組CFs的細胞指數(shù)值持續(xù)性上升，CFs未出現(xiàn)凋亡或死亡現(xiàn)象。與常氧組相比，5%O2組CCK-8 A450nm值顯著性增加(P<0.05)；1%O2組CCK-8 A450nm值顯著性降低(P<0.05)。
　　3.低

5、氧對CFs表型轉化的作用及其表型轉化的相關機制：常氧組CFs中α-SMA免疫熒光染色呈微弱陽性，5%O2組CFs中α-SMA免疫熒光染色呈強陽性。Real-time RCR和Western Blot結果顯示，與常氧組相比，5%O2組CFs中α-SMAmRNA和蛋白的表達水平顯著性增加(P<0.05)。流式細胞技術檢測的結果顯示，常氧組CFs中α-SMA的陽性率是15.24%，5%O2組CFs中α-SMA的陽性率是88.83%。Weste