微球囊壓迫家兔三叉神經節(jié)的病理和生理學變化及外周血單個核細胞移植促進神經修復的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 三叉神經痛(Trigeminal Neuralgia，TN)是屬于功能神經外科領域的一種疾病，據統(tǒng)計約30％-50％患者因不堪忍受疼痛的痛苦而有自殺傾向。作為一種中老年常見疾病，三叉神經痛呈逐年增多趨勢。
　　 近年國內外采用三叉神經節(jié)及神經根位置的治療三叉神經痛的方式如:微球囊壓迫技術(PMC)、射頻熱凝(RF)、半月節(jié)甘油封閉及r-刀等治療雖不同程度的取得了滿意結果，但上述技術手段均會造成患者三叉神經的

2、功能減退或功能障礙，包括感覺功能及運動功能。患者表現(xiàn)為面部麻木、咀嚼無力。個別麻木癥狀明顯，且伴隨不適癥狀，甚至出現(xiàn)了異常的感覺。此外，顏面部外傷或手術（如腮腺腫瘤、上下頜骨惡性腫瘤手術）亦可不同程度的導致三叉神經功能障礙。致使病人生活質量嚴重下降，痛苦不堪，而且尚無有效的治療方法。
　　 為適應臨床需要，我們以家兔作為實驗對象，通過預實驗及參考國外Brown等[12]人的方法研究認為，采用壓迫壓力為1005±150mmHg時，

3、能達到有選擇性的使得大的有髓神經纖維的脫髓鞘改變，而不至于壓力過大造成神經不可修復性損傷。應用微球囊壓迫半月節(jié)方法建立家兔三叉神經半月節(jié)部位的神經損傷的動物模型;研究損傷后神經的病理學變化;從而為神經損傷后修復與再生方法的進一步研究建立實驗室基礎。
　　 臨床上給病人實施PMC時會出現(xiàn)三叉神經抑制反應，表現(xiàn)為心率和血壓的一過性顯著改變，心率下降，嚴重者心臟停搏，血壓下降后又急劇升高，這種危象嚴重者危及患者生命安全，已經引起了臨床

4、醫(yī)生的高度重視，但具體機制目前未完全清楚。
　　 本課題以家兔為實驗對象研究家兔PMC術中是否也會發(fā)生與人類相似的三叉神經抑制反應，以期望為下一步研究發(fā)生三叉神經抑制反應的機理及相應的預防及治療措施建立動物實驗基礎。
　　 神經系統(tǒng)的再生功能是有限制的，損傷后無有效的神經保護和神經再生的治療，歸因于巨噬細胞的浸潤能力弱及膠質細胞瘢痕形成，星形細胞形成膠質瘢痕，成為了神經軸突再生的物理屏障，且瘢痕內含有神經再生抑制因子。<

5、br>　　 外周血單個核細胞(MNC)已被研究證實具有神經再生功能，具有更強的吞噬作用。MNC是血管內皮祖細胞的一部分，MNC體外培養(yǎng)增加缺血性腦組織的VEFG，通過血管再生促進神經再生。被移植的MNC可以分泌多種細胞因子如血管內皮細胞生長因子(VEGF)，作為細胞因子改善神經再生的內環(huán)境從而促進神經再生。
　　 本課題采用球囊壓迫家兔半月節(jié)之后將自體外周血單個核細胞移植入半月節(jié)內，觀察三叉神經節(jié)細胞內VEGF表達及神經節(jié)組織

6、內血管新生的變化。為單個核細胞促進神經再生及神經功能恢復機理提供理論依據，也將為自體外周血單個核細胞將來廣泛地應用于臨床建立實驗室基礎。
　　 材料和方法:
　　 一、微球囊壓迫神經節(jié)方法建立家兔三叉神經損傷模型及損傷后組織學的改變
　　 1、實驗材料
　　 (1)動物:成年健康日本大耳白兔，雌雄不分，體重2.7-3.3Kg
　　 (2)主要試劑:速眠新，蘇醒靈，慶大霉素，Omnipaque造影劑

7、。
　　 (3)主要儀器:No.18薄壁穿刺針，No.2 Fogarty導管，電子天平，石蠟切片機，萬能顯微鏡，透射電子顯微鏡。
　　 2、實驗方法:
　　 (1)建立家兔三叉神經經皮微球囊壓迫損傷的動物模型
　　 (2)經皮穿刺微球囊壓迫家兔三叉神經半月節(jié)
　　 (3)三叉神經節(jié)H&E染色觀察
　　 (4)三叉神經節(jié)細胞直徑測量
　　 (5)三叉神經透射電子顯微鏡觀察
　　

8、 二、微球囊壓迫神經節(jié)引起家兔三叉神經抑制反應的研究
　　 1、實驗材料
　　 (1)動物:成年健康日本大耳白兔，雌雄不分，體重2.7-3.3Kg
　　 (2)主要試劑:速眠新，蘇醒靈，慶大霉素，Omnipaque造影劑。
　　 (3)主要儀器:No.18薄壁穿刺針，No.2 Fogarty導管，交流Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)。
　　 2、實驗方法:
　　 (1)家兔實施PMC手術

9、
　　 (2)檢測采集穿刺針刺入卵圓孔、No.2球囊導管進入及球囊擴張三叉神經節(jié)受到壓迫三個時期記錄各時相血壓和心率值。
　　 三、外周血單個核細胞移植對三叉神經損傷的神經修復與保護作用初步研究
　　 1、實驗材料
　　 (1)動物:成年健康日本大耳白兔，雌雄不分，體重2.7-3.3Kg
　　 (2)主要試劑:二甲苯，生物素化山羊抗兔IgG，CD105，辣根酶標記鏈酶親合素，無水乙醇，蘇木精，山羊

10、血清，PKH-26染料，稀釋液C，EDTA，DAPI，pkh26，抗熒光淬滅劑。
　　 (3)主要儀器:電熱恒溫鼓風干燥箱，-30℃恒冷低溫切片機，電熱恒溫培養(yǎng)箱，超純水系統(tǒng)，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，超速冷凍離心機，激光共聚焦顯微鏡。
　　 2、實驗方法:
　　 (1)兔外周血單核細胞的分離及PKH-26標記
　　 (2)三叉神經半月節(jié)PMC損傷后局部單個核細胞移植
　　 (3)免疫熒光檢查半月

11、節(jié)切片
　　 (4)免疫組化法觀察神經節(jié)細胞VEGF的表達及神經節(jié)內微血管密度
　　 (5)電鏡觀察移植組及對照組髓鞘
　　 實驗結果:
　　 一、微球囊壓迫神經節(jié)方法建立家兔三叉神經損傷模型及損傷后組織學的改變
　　 1.通過解剖定位、建立了微球囊壓迫半月節(jié)三叉神經損傷模型。
　　 2.正常神經節(jié)細胞質HE染色被染呈紅色，核深染，形態(tài)規(guī)則，周邊有扁平的神經膠質細胞即衛(wèi)星細胞包繞。電鏡下正

12、常髓鞘呈同心圓形排列，較規(guī)則，有大的有髓神經纖維及小的有髓神經纖維，前者髓鞘厚度相對較厚。兔PMC后2周、4周電鏡顯示主要為大的有髓神經纖維空泡形成、碎裂、脫髓鞘病變，呈蟲蝕樣改變，髓鞘之同心圓板層結構模糊，板層間隙增寬，松散，扭曲，形狀不規(guī)則。
　　 3.PMC后1天、7天、14天及28天的細胞實際直徑組內數(shù)據無顯著性差異(P＞0.05)，組間數(shù)據亦無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 二、微球囊壓迫神經節(jié)引起家兔三叉

13、神經抑制反應的研究
　　 穿刺針進入卵圓孔、No.2球囊導管置入及球囊擴張三叉神經節(jié)受到壓迫時兔的心率和平均動脈血壓都有明顯的下降（P＜0.01)。而穿刺針插入卵圓孔后心率為293±28bmp、平均動脈血壓為76±8mmHg，與穿刺針插入前同一指標相比無顯著性差異（分別為P＞0.05和P＞0.05）;球囊導管置入安放到位后兔的心率286±16bpm和平均動脈血壓82±12mmHg與球囊導管置入前同一指標相比亦無顯著性差異（分別為

14、P＞0.05和P＞0.05）;球囊導管擴張前后兔的心率無顯著性差異(P＞0.05)而平均動脈血壓有顯著性差異（P＜0.05)。
　　 三、外周血單個核細胞移植對三叉神經損傷的神經修復與保護作用初步研究
　　 1.外周血單個核細胞半月節(jié)移植后1天，顯微鏡下可以觀察到被PKH-6標記的單個核細胞，呈紅色;7天后，仍能觀察到PKH-26標記的單個核細胞，但數(shù)量減少;14天后幾乎觀察不到紅色的PKH-26標記的單個核細胞。

15、>　　 2.正常對照組VEGF多為陰性表達，少數(shù)有較弱的陽性表達;壓迫組神經節(jié)細胞及軸突中均有VEGF陽性表達，VEGF多表達于細胞漿中，神經纖維脫髓鞘，染色質聚邊、核濃染現(xiàn)象;MNCs移植組神經節(jié)細胞及軸突中VEGF陽性表達呈強陽性。
　　 3.與正常細胞體，對照組及移植組的三個時間點的灰度值均較正常組低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);移植組三個時間點的灰度值均較對照組更低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);對照組及移植組組

16、內7天及14天灰度值無明顯差別(P＞0.05)，但28天時均升高(P＜0.05)。
　　 4.對照組及移植組在7天、14天均有新生血管生成，而移植新生血管增多更明顯，兩組7天新生血管生成達高峰，14d新生血管生成開始減少，但移植組14天時可以觀察到新生成的血管管腔形成。
　　 5.與壓迫組相比，移植組7天及14天三叉神經的脫髓鞘改變更加明顯，14天時可見成片的神經脫髓鞘改變，程度劇烈，可見到單核細胞浸潤吞噬髓鞘碎片，28

17、天兩組無明顯區(qū)別。
　　 結論:
　　 1.微球囊壓迫半月節(jié)方法可以制作三叉神經損傷的動物模型，為神經損傷后促進神經修復與再生的進一步研究建立了實驗室基礎。
　　 2.三叉神經微球囊壓迫后不同時間呈現(xiàn)不同程度的神經脫髓鞘的改變，而神經節(jié)細胞的直徑無明顯變化，為神經再生及修復提供支持。
　　 3.經皮穿刺微球囊壓迫家兔三叉神經半月節(jié)能引起與人類相似的三叉神經抑制反應。家兔可以作為研究經皮穿刺微球囊壓迫治療三