膠原酶產生菌的鑒定及所產膠原酶酶學特性研究.pdf

1、目的：分離、純化并鑒定人初乳樣本中具備蛋白水解能力的菌株，進一步確定產酶菌株膠原酶的編碼基因以及分子結構特性，最終利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)進行原核表達，并對表達的重組酶進行純化以及酶學性質研究。
　　方法：以牛奶平板培養(yǎng)法分離并純化產酶菌株，利用16Sr DNA序列分析以及API CH50培養(yǎng)基分析菌株的遺傳特性與生化特性，最終鑒定產酶菌株所屬類型。其次，利用串聯(lián)質譜技術分析產酶菌株所產酶的類型，再結合質譜分析結果以菌株基因組DN

2、A為模板采用PCR法獲得膠原酶colR75E基因，構建pET28a/colR75E重組質粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達，利用Ni-NTA純化的方式獲得高純度ColR75E膠原酶，利用膠原酶譜、膠原酶活力測定、Ⅰ型膠原蛋白降解產物電泳檢測等方式對ColR75E膠原酶的酶學特性進行分析。
　　結果：通過16Sr DNA序列分析以及API CH50培養(yǎng)基分析可知人初乳樣本中的產酶菌株為一株蠟樣芽孢桿菌，根據串聯(lián)質譜結果

3、結合生物信息學分析可知產酶菌株所產的蛋白酶為一種可分泌至胞外的膠原酶，對該酶進行基因克隆及原核表達后，通過Ni-NTA純化獲得的蛋白經膠原酶譜、Ⅰ型膠原蛋白降解產物的檢測時均表現(xiàn)出膠原蛋白的降解能力。在標準條件下測得其比活力為3.62 U/mg，Km為25.55μmol/L（2.93 mg/mL），Vmax為5.71μmol/(mg?min)。ColR75E膠原酶的最適反應溫度為45℃，最佳反應pH為8.0。此外，ColR75E膠原酶對

4、于不高于50℃的溫度以及pH6.0-8.0的酸堿度范圍具有良好的穩(wěn)定性。ColR75E膠原酶可被Ca2+激活、但被Zn2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+等金屬離子抑制，抑制能力依次為Pb2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+。ColR75E膠原酶對EDTA和EGTA的高敏感性進一步證實了該膠原酶為一種金屬蛋白酶。
　　結論：本研究分離鑒定了一種可分泌膠原酶的蠟樣芽孢桿菌，構建了相應膠原酶的原核表達系統(tǒng)，最終證實利用原核表達系統(tǒng)大量獲得